[发明专利]从微生物发酵获得的碳水化合物中纯化乳-N-新四糖(LNnT)的简单方法

说明书

提供一种从其它碳水化合物中纯化乳‑N‑新四糖的方法，其特征在于该方法包含使用不同的膜将含有乳‑N‑新四糖的水溶液进行两次膜过滤的步骤或将含有乳‑N‑新四糖的水溶液进行一次膜过滤步骤和一次连续色谱法步骤。

技术领域

本发明涉及纯化乳-N-新四糖(Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)的方法。更具体地，本发明涉及一种用于从其它碳水化合物中分离乳-N-新四糖的简单且经济的方法，这些碳水化合物为例如乳-N-三糖、乳糖和单糖以及较大的寡糖例如对-乳-N-新六糖，对于通过微生物发酵来制备乳-N-新四糖来说，这些碳水化合物被认为是发酵液中的杂质碳水化合物。

背景技术

人乳被认为是婴儿发育的最佳饮食。它由脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素和复合寡糖组成。除乳糖外，人乳以及其它哺乳动物的乳还含有各种结构各异的寡糖，它们被称为人乳寡糖(HMO)(Usashima T.等，(2011)Milk Oligosaccharides，Nova BiomedicalBooks，New York ISBN 978-1-61122-831-1)。

由于HMO对胃肠道菌群发育的有益特性，通过化学方法或基于生物技术的方法来制备HMO的努力引起了广泛关注，因此提倡将其用于营养产品(尤其是婴幼儿营养产品以及医疗和成人营养产品)。

除了这些益生菌特性外，迄今为止还观察到HMO的许多其它有益效果，扩大了其应用领域(Morrow A.L.Yu，Y.(2017)Potential public health impact of human milkOligosaccharides.In：Prebiotics and probiotics in human milk.McGuire，M.，McGuire，M.Bode，L.(Eds.)Academic Press，London，pp 207-222)。

有限的供应以及获得单个人乳寡糖纯级分的难度，导致这些复杂分子中的一些分子的化学合成方法得到发展。然而，通过化学合成、酶促合成或发酵来合成人乳寡糖，仍然具有挑战性。时至今日，对于大规模量的生产制造，以及制造对于食品应用而言是足够量的人乳寡糖，仍然是有难度的。

由于化学合成人乳寡糖过程中带来的诸多挑战，现已发展几种酶促方法和发酵方法。特别地，发酵方法需要从含有几百种不同分子的高度复杂的发酵液中纯化目标寡糖。发酵液中碳水化合物级分由单糖以及寡糖的复杂混合物组成，包括底物(例如乳糖以及作为碳源的其它糖类)、生物合成中间体、各类单糖、代谢副产物以及由微生物合成的其它多糖。此外，发酵液中出现的许多寡糖的结构是未知的(例如，由合成宿主天然产生的寡糖，譬如细胞表面糖基化结构)。因此，在很多情况下，生物技术产品的纯化比其发酵生产要昂贵得多。特别地，乳-N-新四糖的发酵通常会伴随有乳-N-三糖II的过量合成，它是乳-N-新四糖的生物合成过程的生物合成中间体，通常由细胞输出至介质中。可以通过糖苷酶处理或纯化过程中的色谱分离步骤除去发酵液中的乳-N-三糖II。由于乳-N-新四糖的非还原端有β-1,4-连接的半乳糖残基，非还原端十分类似于乳糖，其通常通过微生物发酵菌株中存在的糖基转移酶或生物催化反应中使用的糖基转移酶引起进一步的糖基化反应。这导致生成戊糖、己糖、庚糖以及甚至更大的寡糖(目标乳-N-新四糖产物的过糖基化)。此外，碳水化合物(例如乳糖)的高压灭菌(热处理)会导致生成不希望的副产物例如羟醛或mayard产物，或重排反应(例如乳糖转化为乳果糖)。最终产物中此类杂质的存在(特别是大量存在)是不想要的或者是不可接受的。

从发酵液中纯化单个寡糖的“现有技术”方法，从技术层面而言是复杂的而且通常是不经济的，尤其是当所述寡糖用于食品时。对于从复杂混合物例如乳清或糖浆中纯化二糖乳糖或蔗糖而言，已经开发了涉及多个结晶步骤的工业规模方法。然而，所述方法需要精细操作，并且仅导致低产率。此外，这些方法不适用于使糖适合用于食品工业，因为乳清和糖浆已经是食品。