[发明专利]在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法

说明书

本发明涉及在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法，包括在植物细胞的组织培养过程中优化温度及光周期条件或者利用多复制子(multiple replicon)来表达同源介导的双链DNA修复(HDR，homology‑directed DNA repair)所需因子及效率增加因子或者调节非同源末端连接(NHEJ，non‑homologous end joining)途径的步骤。

技术领域

本发明涉及在植物体中基于同源重组提高基因编辑效率的方法。

背景技术

在植物系统中通过同源重组(HR，homologous recombination)或同源介导的双链DNA修复(HDR，homology-directed DNA repair)的基因组校正技术在在植物基因工程研究中被认为是里程碑式的领域。虽然同源重组常发生在生成单倍体的生殖细胞的减数分裂中，但并未发生在体细胞的有丝分裂。据报告，同源介导的双链DNA修复为与非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)一同在DNA受损时发生的修复途径，同源介导的双链DNA修复的发生频率为非同源末端连接的1/1000。据1990年代初的报告，在烟草属植物(Nicotiana species)中双链断裂(DSB，double strand break)可增加同源介导的双链DNA修复，虽然早在20年前便已公开通过诱导双链断裂来使基因组变形的基因剪刀或基因组校正/编辑技术，但基因组校正/编辑技术的使用在植物系统中是非常受限的，而且，随着最近3代成簇的规律间隔的短回文重复序列/其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的导入，提高同源介导的双链DNA修复效率的研究也逐渐活跃。若使用成簇的规律间隔的短回文重复序列/其相关蛋白9系统向基因组的特定位置基因造成双链断裂，则当通过作为在体细胞中优势的DNA修复途径的非同源末端连接途径发生DNA修复时，通常因不确定的修复可生成多种插入缺失(insertion-deletion，Indel)突变。虽然这种技术有利于获取随机化的插入缺失突变，但并不属于真正的基因组校正/编辑技术。基于同源介导的双链DNA修复的基因组校正/编辑技术是一种可以随意更改DNA碱基序列的技术，例如，外来基因的靶特异性插入、切割特定DNA片段或代替相似的DNA等，通过双链断裂的诱导可大幅提高同源介导的双链DNA修复的效率的事实在同源介导的双链DNA修复研究中起到非常重要的作用。然而，尽管双链断裂诱导大幅提高了同源介导的双链DNA修复的效率，但同源介导的双链DNA修复效率仍然非常低，仅为非同源末端连接的约1/100，这与实际应用相差甚远。因此，为了通过双链断裂改善植物同源介导的双链DNA修复技术，已经付出了许多努力，其中，通过使用病毒复制子(viral replicon)取得了备受瞩目的进步。