[发明专利]一种密码子优化的人胰岛素类似物前体基因和信号肽基因

说明书

提供一种密码子优化的人胰岛素类似物前体基因和信号肽基因的核酸分子。该核酸分子包含一种融合胰岛素类似物前体的编码核酸分子和一种酵母分泌信号肽α‑因子的编码核酸分子。该核酸分子使得胰岛素类似物前体在毕赤酵母中的表达量提高，降低人胰岛素类似物的生产成本。

技术领域

本发明涉及一种密码子优化的人胰岛素类似物前体基因和一种密码子优化的α-因子(α-factor)信号肽基因，并提供了所述人胰岛素类似物前体基因的表达方法。

背景技术

人胰岛素是由51个氨基酸组成的多肽，包含两条链，分别为A链和B链。胰岛素的主要药效是调节糖代谢，在糖尿病治疗中，胰岛素干预作为替代或补充治疗是最直接有效的方法。胰岛素还有促进脂肪合成、抑制脂肪分解、减少酮体生成的作用，所以亦被用来纠正胰岛素相关酮症和酸血症的各种症状。

胰岛素最早一直由猪、牛等动物胰腺提取而得，但这些产品与人胰岛素结构有所不同，故存在免疫原性。上世纪八十年代初、中期美国礼来和丹麦诺和诺德公司相继开发出基因重组人胰岛素生产技术，从此基因工程表达人胰岛素及其类似物成为工业主流手段。但是人胰岛素作用时间较短，使得病人必须频繁注射，极为不便。因此，人们致力于获得一些能够更长时间作用于人体的胰岛素类似物及其衍生物。其中，使用酰化基团修饰人胰岛素或其类似物，是一种提高其半衰期的有效方法。WO2018024186公开了一种B29位被长链脂肪酸取代、B30位氨基酸缺失的人胰岛素类似物，公开了该人胰岛素类似物的结构和生物活性。WO9507931公开了一种B29位连接一个十四酰基侧链、B30位氨基酸缺失的胰岛素类似物及其制剂。WO2005012347公开了一种B29位被一个谷氨酸和长链脂肪酸取代、B30位氨基酸缺失的人胰岛素类似物。目前常用的表达人胰岛素及其类似物的表达系统主要有是大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母，其中大肠杆菌表达为包涵体形式，需经过包涵体裂解和复性，工艺繁琐且得率低，酿酒酵母与毕赤酵母有着操作简易、易于培养、对外源蛋白修饰、可以分泌表达等遗传表达优点，但酿酒酵母分泌效率低、表达菌株不够稳定，相比之下毕赤酵母是工业生产重组蛋白应用更广泛的表达系统。工业上，生产过程中发酵产量是控制生产成本的关键因素，由于胰岛素市场需求量大，作为重要生产商的诺和诺德利用酵母表达生产时罐子规模达到几十吨，对厂房、设备要求很高，成本也高，所以提高人胰岛素及其类似物的发酵产量对工业生产有着重要意义。

遗传密码子是三联体密码，一个密码子由信使核糖核酸(mRNA)上相邻的三个碱基组成。遗传密码共有64种，但不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对不同密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。外源基因的密码子主要在翻译水平上影响基因的表达，很多文献已经证明密码子的优化对于在毕赤酵母中提高外源蛋白的表达量卓有成效。毕赤酵母表达外源基因分为胞内表达和分泌表达两种，后者需要信号肽来引导外源基因表达产物的分泌，目前最普遍使用的信号肽为来源于酿酒酵母α-因子信号肽，其核苷酸序列也来源于酿酒酵母，目前还没有报道针对毕赤酵母优化的α-因子信号肽核苷酸序列。胰岛素前体密码子优化的相关文献很多，如Gurramkonda等人优化的人胰岛素前体基因序列并在毕赤酵母的表达研究(Gurramkonda et al.Application of simple fed-batchtechnique to high-level secretory production of insulin precursor usingPichia pastoris with subsequent purification and conversion to humaninsulin.Microbial Cell Factories，2010，9：31)，专利WO1998028429公开了表达人胰岛素类似物前体的基因序列，该基因编码的胰岛素前体氨基酸序列是EEGEPK-B(1-29)-AAK-A(1-21)，其中EEGEPK为胰岛素前体N端延伸，称为间隔肽或前导肽，可以保护胰岛素前体的N端免于酵母蛋白酶的水解作用，并且能提高胰岛素前体的表达效率；B(1-29)是缺失B30位苏氨酸的人胰岛素B链；A(1-21)是人胰岛素A链氨基酸序列；AAK为连接B链和A链的连接肽，也称为C肽。