[发明专利]一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种腺相关病毒衣壳蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；公开了一种分离的核酸分子，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白；公开了一种腺相关病毒载体，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白；还公开了上述腺相关病毒载体的构建方法及其在制备基因治疗药物中的应用。本发明在AAV‑DJ衣壳蛋白上进行了改造，使得其在HEK293、各种肝癌细胞、小鼠成纤维细胞等细胞系以及小鼠肝脏中与野生型AAV相比转导效率都得到了显著的提升，避免了高剂量注射病毒载体会引发受体的免疫反应，优化了AAV病毒的生产工艺，降低生产成本，促进了AAV基因治疗产品推进临床的进程。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用。

背景技术

当前，基因治疗成为生物医药领域的研究热点，基因治疗中最常用的载体包括腺病毒、慢病毒以及腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV，下同)。野生型腺相关病毒(wtAAV，下同)隶属于细小病毒科，是一个直径为20nm的单链DNA病毒，呈一个二十面体，衣壳蛋白里包被着一个两端含有倒置末端重复序列(ITR，下同)的病毒基因组，ITR之间是一个开放阅读框ORF，包含衣壳蛋白Cap、复制蛋白Rep、包装激活蛋白AAP。已知野生型腺相关病毒会整合到人染色体AAVS1位点。重组型腺相关病毒(rAAV，下同)基因组序列只保留了包装病毒所必需的两端的ITR，中间全部替换为目的基因序列，这就保证了病毒基因组不整合进宿主基因组。

与腺病毒、慢病毒相比，重组型腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus，rAAV，下同)在人体中诱发免疫应答的几率较低，这有助于提高载体递送目的基因的效率，同时使用rAAV可以降低来自免疫相关的毒性风险；此外，rAAV可在体内外长期有效介导外源基因的持续稳定表达，已成为最有前景的基因治疗载体之一。但是，rAAV的转导效率受目的基因序列的长度影响，所转导的细胞、组织脏器种类不同选用的血清型也不同，加之AAV生产包装成本相对高昂，且高剂量注射会激发人体的免疫反应。故而，如何对AAV进行改造,使其在原代培养的细胞、胆管类器官、哺乳动物细胞和动物脏器等体内外实验中与wtAAV相比转导效率都得到显著的提升；如何让滴度较低的病毒载体和以wtAAV包装得到的高剂量的病毒载体相比，转导细胞的效率都能达到近似水平，以此减少传统基因治疗对所需要的病毒载体量的需求，避免高剂量注射病毒载体诱发受体的免疫反应；如何通过对AAV衣壳蛋白进行优化，提高病毒载体的靶向性，为实现精准医疗提供有效技术支撑；如何通过对AAV衣壳蛋白的优化改造，优化AAV病毒的生产工艺，降低生产成本，生产出更加稳定的病毒载体，促进AAV基因治疗的产品推进临床的进程显得至关重要。

发明内容

有鉴于现有技术转导效率低等缺陷，本发明提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用。

本发明的技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白，其在DJ血清型衣壳蛋白的第269位氨基酸上由丝氨酸突变为苏氨酸(S269T)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明在第二方面提供了一种分离的核酸分子，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)。

本发明在第三方面提供了一种腺相关病毒载体，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)。

本发明在第四方面提供了一种腺相关病毒载体，其包含上述分离的核酸分子。

本发明在第五方面提供了上述腺相关病毒载体的构建方法，其包括以下步骤：

步骤1：选择表达腺相关病毒DJ血清型衣壳蛋白的质粒作为PCR扩增的DNA模板；

步骤2：设计定点突变的引物，所述定点突变在wtAAVDJ衣壳蛋白VP1上将其第269位氨基酸由原来的丝氨酸突变为苏氨酸(S269T)；