[发明专利]一种用于目标区域捕获测序的DNA捕获探针制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于目标区域捕获测序的DNA捕获探针制备方法及其应用。本发明提供了一种制备用于目标区域捕获测序的DNA捕获探针的方法，依次包括如下步骤：(1)用芯片合成仪合成探针oligo DNA；所述探针的两端均具有限制性内切酶识别序列；(2)以探针oligo DNA作为模板进行扩增反应；(3)进行滚环DNA扩增；(4)采用所述限制性内切酶进行酶切。本发明可以降低探针制备成本，同时通过RCA扩增降低累计错误。采用本发明提供的方法制备探针，单次合成成本大大降低，可以通过现有的合成RNA探针的仪器和设备合成DNA探针，并且可以获得不亚于进口DNA探针的杂交效果。

技术领域

本发明涉及一种用于目标区域捕获测序的DNA捕获探针制备方法及其应用。

背景技术

2003年，人类基因组计划绘制了人类基因组图谱。然而，今天，即使有完整的基因组作为参考序列，在某人的DNA中发现致病突变仍然比大海捞针还困难。因此外显子组测序应运而生，为其提供了解决方案。

基因组中所有的蛋白质编码区域约占总DNA的1％-2％，统称为外显子。这些区域分布在整个基因组中，被其他非编码DNA区域包围。外显子区域对于理解许多疾病的遗传原因非常重要，因为改变外显子中的一个碱基对就可能破坏蛋白质的功能。虽然外显子只占整个人类基因组的1％左右，但已知导致疾病的85％的基因突变可以在那里找到。

外显子组测序通过严格关注蛋白质编码区域，简化了对致病突变的搜索。这大大减少了需要测序的基因组DNA的数量，以获得有关疾病的有意义的信息。事实上，仅通过观察外显子组，测序效率就可以提高2000％以上，从而降低了临床筛选的成本和等待时间。

靶向测序则是专注于感兴趣的区域，它有两种不同的技术：通过杂交方法进行广泛的目标捕获，更专注的设计基于PCR的扩增子。与其他NGS方法(如全基因组测序或全外显子测序)相比，靶向测序目标基因组序列较少，因此只对感兴趣的目标区域进行排序，这意味着通过将测序区域集中到感兴趣的区域，基因组序列可以在任何地方进行富集，其富集程度是DNA测序的1亿到100万倍，这是靶向测序最重要的优点之一。对于某些应用来说,典型的10倍或100倍深度的DNA测序甚至更大深度的外显子组测序获得的数据可能是不够的,如检测低水平的体细胞变异,可能需要3000x覆盖或更多，以发现5％或更低的频率，这是至关重要的。同样，通过NGS进行深度测序比Sanger测序对这些低频突变进行检测可信度更高。

目前市场上主要的DNA捕获探针生产厂商有罗氏(Roche)、IDT(IntegratedDNATechnologies)、Twist Bioscience，目前三家公司都是采用直接合成oligo的方案，不涉及制备过程，也不存在专利冲突风险。直接合成oligo的方案成本较高，因此也带来了市售DNA探针价格居高不下的结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于目标区域捕获测序的DNA捕获探针制备方法及其应用。

本发明提供了一种制备用于目标区域捕获测序的DNA捕获探针的方法，依次包括如下步骤：

(1)用芯片合成仪合成探针oligo DNA；所述探针的两端均具有限制性内切酶识别序列；

(2)以探针oligo DNA作为模板进行扩增反应；

(3)进行滚环DNA扩增；

(4)采用所述限制性内切酶进行酶切。

所述探针oligo DNA是采用Generate_oligos软件设计的。

示例性的，所述芯片合成仪可为OligoArray芯片合成仪。

示例性的，所述限制性内切酶可为限制性内切酶Mly I。

所述方法还包括将步骤(4)的酶切产物进行纯化的步骤。