[发明专利]基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组、试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组及试剂盒。目前的方法都难以实现HPV高通量样本检测。在检测样本量需求大的时候，需要大量的人力进行操作。本发明建立的方法可通过一步法扩增和纯化，一步法建库，中途不转管，不开盖，有效避免样本之间混淆或者交叉污染；5个小时能够完成96个样本的文库构建，操作简便，能够轻易实现大量样本的检测。通过增加接头引物中样本标签的的数目，可以增加一次测序能够完成的样本检测数目，进一步减少单个样本的平均手工操作时间。

技术领域

本发明属于二代测序领域，具体涉及基于高通量测序检测HPV的多重PCR引物组、试剂盒及其方法。

背景技术

根据世界卫生组织2018年的统计数据，宫颈癌是全球第四大女性恶性肿瘤，2018年新增的病例接近57万例，因宫颈癌死亡超过31万人。全球范围内，宫颈癌患者呈逐年上升以及年轻化的趋势。我国的新增病例每年超过10万例；其它发展国家/地区的发病人数更是超过了总数的85%。

宫颈癌是目前唯一病因明确、可以早期预防和治愈的恶性肿瘤，99.9%的宫颈癌与人类乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus；HPV）感染相关，高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的必要因素，且不同型别的HPV感染带来的风险不同。研究表明，超过七成女性一生中至少有一次HPV病毒感染，但绝大多数HPV感染都能够被机体自身的免疫系统清除，只有1%-4%的HPV感染者会逐渐发展病变，最终导致癌变。世界卫生组织建议，30-49岁的女性，每3-5年做一次细胞学筛查，或者每5年做一次HPV筛查。因此，推行规范有效的HPV筛查策略宫颈癌防治的关键。

高通量测序，又称大规模平行测序，或者二代测序。高通量测序能一次过一个样本多个目标区域或者多个样本进行测序，其在临床，包括药物基因组学，遗传病研究和筛查，肿瘤突变基因检测以及临床微生物检测上的应用也逐渐得到重视。整个高通量测序流程包括样本的核酸提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。首先，提取的核酸样本在进行高通量测序之前，需要进行文库构建，一是给样本带上测序仪器能够识别的特异性片段，以便于让样本进行模板制备和能够被测序仪识别并且进行测序；二是给样本带上样本特异性标签，以区分不同的样本，达到一次过同时对多个样本进行测序，降低当样本的测序成本。

目前文库构建的主要方式有杂交捕获和多重PCR。

杂交捕获是指通过设计特异识别目标区域的探针库，对目的区域进行特异性结合然后捕获的过程。杂交捕获流程包含：核酸片段化-末端修复-连接加接头-扩增-预文库纯化-目标区域捕获-文库扩增-纯化等步骤。这种建库方式流程长，整个超过流程需要超过24个小时；操作复杂，当中有许多精细的步骤，对操作人员的能力要求比较高。因此，杂交捕获用于大规模样本上的文库构建相对困难。

多重PCR建库方法是对PCR技术的拓展性应用。目前使用的多重PCR建库方法的操作流程包括：PCR、部分引物消化、连接加接头、样本纯化等。操作相对比较简单，实验人员较容易掌握。但在操作过程中，完成PCR之后存在一步或者多步开盖以进行后续操作，样品容易受环境气溶胶污染；同时，样本PCR之后产生的气溶胶也可能会对后续的检测样本产生污染；另外，多重PCR的开发难度较大，除了需要考虑引物的特异性，还需要考虑引物的错配以及引物之间形成的二聚体问题，引物越多，形成错配或者二聚体的可能性越大。

无论是杂交还是多重PCR，在操作过程中，都存在转管或者PCR之后的开盖操作，存在有样本相互之间交叉污染的可能性；而且每个样本都需要进行多步骤操作，操作复杂，在应对大量的样本时存在困难。

根据以上问题，本发明致力于研究一种基于高通量测序的HPV检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高通量测序的HPV检测方法及应用，利用多重PCR的方法，解决样品检测过程中样本容易污染、检测结果不够精确、样本量大等问题。

本发明所采取的技术方案是：