[发明专利]一种热稳定性提高的枯草蛋白酶E突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体，属于生物工程技术领域。本发明是将氨基酸如SEQ ID NO.1所示的枯草芽孢杆菌蛋白酶E进行突变，将其编码的第158‑162位的环序列SSGSS突变为天冬氨酸N，将含突变基因的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到热稳定性提高的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体M21。突变体M21在55℃下的半衰期较野生型延长21.55min。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的枯草蛋白酶E突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌蛋白酶E(Subtilisin E)，简称枯草蛋白酶E，是一种由微生物产生、可以降解蛋白类底物的碱性丝氨酸蛋白酶。枯草芽孢杆菌蛋白酶E作为一种底物专一性宽泛、水解催化能力强和碱性的pH值偏好的蛋白酶，在洗涤剂、皮革和食品工业中有着广泛的应用。特别是在乳制品工业中，它们在生产生物活性水解物方面具有巨大的潜力。随着工业化的发展，野生菌所产枯草芽孢杆菌蛋白酶E性能和产量远远不能满足市场需求。

目前筛选得到的产枯草芽孢杆菌蛋白酶E野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高枯草芽孢杆菌蛋白酶E生产强度。重组枯草芽孢杆菌蛋白酶E一般经过性能改造，胞外酶活单一，简化了发酵下游的纯化工作。另外，工业化应用上对酶的要求苛刻，如高温环境会很大程度影响枯草芽孢杆菌蛋白酶E活性。为减省生产成本，必须实现枯草芽孢杆菌蛋白酶E重复利用，另外还需要催化活力高、底物专一性强的枯草芽孢杆菌蛋白酶E进行精细化学的催化。人们从自然界筛选分离的枯草芽孢杆菌蛋白酶E已经远远不能满足工业化需求，所以通过分子改造技术寻求新型枯草芽孢杆菌蛋白酶E将是一个新的研究方向。

发明人前期对来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S7的枯草芽孢杆菌蛋白酶E(SES7)进行了异源表达(专利公开号为：CN109837219A)，获得了高可溶性表达的枯草芽孢杆菌蛋白酶E。但在大肠杆菌的胞内表达中，胞外热稳定性较差。为了进一步提高酶的应用性能，有必要进一步提高枯草芽孢杆菌蛋白酶E的热稳定性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体，其含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将其编码的第264-268位的环序列SSGSS突变为天冬氨酸N，得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体命名为M21。

本发明的第二个目的是提供编码上述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，编码上述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.11所示的序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒是在pET系列质粒、pGEX系列质粒、pPICZ系列质粒、pAN系列质粒或pUB系列质粒中的任意一种质粒的基础上构建得到的。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是细菌、酵母或者其他真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主。

本发明的第五个目的是提供一种增强枯草芽孢杆菌蛋白酶E热稳定性的方法，是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将其编码的第264-268位的环序列SSGSS突变为天冬氨酸N。