[发明专利]一种脂肪体及其在评价待测蛋白与脂滴相互作用中的应用

说明书

本发明公开了一种脂肪体及其在评价待测蛋白与脂滴相互作用中的应用。通过涡旋混合甘油三酯和磷脂，使用两步法纯化，制备出由甘油三酯核心和单层磷脂膜构成的脂肪体；磷脂为“DOPC和PI”、“DOPC和PA”、“DOPC和PS”、“DOPC、PI和DOPE”、“DOPC、PA和DOPE”或“DOPC、PS和DOPE”。同时发现脂肪体具体如下用途：检测待测蛋白在脂滴上的结构、形态和/或密度，评价待测蛋白和脂滴相互作用，检测待测蛋白和脂滴的亲和力，检测ATGL酶活性，分析待测蛋白中氨基酸残基的位置和/或种类对待测蛋白在脂滴的定位的影响，分析磷脂组分对待测蛋白在脂滴的定位的影响。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肪体及其在评价待测蛋白与脂滴相互作用中的应用。

背景技术

脂滴是单层磷脂膜包裹中性脂核心、表面被覆蛋白的多功能细胞器，它参与脂质的合成、储存、代谢和转运，蛋白的储存和降解，脂质信号分子和激素的修饰和合成，并与其它细胞器发生动态相互作用。脂滴的蛋白和脂质组分的改变均可能导致脂滴功能的异常，进而引起人类代谢疾病的发生。因此，脂滴生物学的研究重要性日益凸显。

借助蛋白质组学和脂质组学的技术手段，不同物种的脂滴的蛋白质和脂质组成日益清晰。但是，由于体内研究系统复杂，脂滴与其它细胞器有相互作用，蛋白的敲除或过表达可能引起其他蛋白的补偿作用，并且无法精确改变脂滴的脂质组分，因此，为了全面地理解脂滴的形成、功能和调控机制，构建了人工脂滴。

脂肪细胞分化相关蛋白(ADRP)是主要的脂滴常驻蛋白之一。然而，调控ADRP脂滴定位的机制还不明确。脂滴中，甘油三酯是中性脂核心的主要组成部分。甘油三酯通过脂肪水解酶ATGL分解为脂肪酸，脂肪酸被用作细胞能量和物质合成原料。ATGL活性降低会引起各个组织脂肪过度积累而导致代谢疾病的发生。磷酸化是调控脂类水解酶活性的机制之一。人们已经发现了ATGL的八个磷酸化位点，其中Ser406 S396调控其活性，Thr372调控其定位。但是，其它磷酸化位点在脂滴定位和活性调控中发挥怎样的作用，哪些蛋白和脂质参与了ATGL的调控仍不清楚。因此，ATGL的活性和细胞定位的调控机制有待进一步研究。由于体内研究系统复杂，蛋白的敲除或过表达可能引起其它蛋白的补偿作用，无法研究磷酸化这一单一因素对ATGL活性的影响。

发明内容

本发明的目的是制备一种新的脂肪体，并研究脂肪体的应用。

本发明首先保护一种制备脂肪体的方法，可包括步骤：a1)将磷脂和甘油三酯在缓冲液中进行涡旋以实现两者的反应，然后进行离心，收集上层液相，从上层液相中分离得到脂肪体；磷脂和甘油三酯的质量比可为d1)至d6)中的任一种：d1)0.25～3:5；d2)3:5；d3)2:5；d4)1:5；d5)1:10；d6)1:20；

所述磷脂为B1)、B2)、B3)、B4)、B5)、B6)或B7)：B1)DOPC和PI；B2)DOPC和PA；B3)DOPC和PS；B4)DOPC、PI和DOPE；B5)DOPC、PA和DOPE；B6)DOPC、PS和DOPE；B7)DOPC和胆固醇。

所述“从上层液相中分离得到脂肪体”可包括如下步骤：

a2)将所述上层液相进行两次以上的纯化；每次纯化的方法可为：将上层液相与所述缓冲液混匀，然后使其分层，收集上层液相；

a3)将步骤a2)得到的上层液相与所述缓冲液混合，然后使其分层，收集下层液相，其中含有脂肪体。

所述缓冲液可为缓冲液B。

所述缓冲液B的溶质及其在缓冲液中浓度可为：15mM～25mM HEPES，80mM～120mMKCl，1.5～2.5mM的MgCl₂；溶剂可为去离子水；pH可为7.2～7.6。