[发明专利]一种人凝血因子IX的制备方法

说明书

为了解决现有人凝血因子IX产品的不稳定问题，本发明提供了一种人凝血因子IX的制备方法，属于生物制品领域。本发明公开方法包括如下步骤：(1)血浆去除冷沉淀；(2)阴离子交换层析纯化；(3)病毒灭活；(4)阴离子交换层析纯化；(5)肝素亲和层析纯化；(6)疏水层析纯化；(7)经超滤、深层过滤，或者深层过滤、超滤；以及除菌、除病毒和冻干步骤。本发明还提供了所述方法制备得到的产品，包括凝血因子IX原液和冻干品。本发明的工艺由于能制备人凝血因子IX原液，可以支持人凝血因子IX原液配制前的中间品冻存后合批，大大降低了冻干的能耗、减少了操作人员的工作量。

技术领域

本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种人凝血因子IX的制备方法及其制剂。

背景技术

乙型血友病的早期治疗方案为输注新鲜血浆或新鲜冰冻血浆。需输注的剂量大且有高血容量的危险，心脏负荷过重，副作用较大，且病毒感染的风险大，因而血浆不是治疗的理想药剂。为减少这些副作用，20世纪50年代末开始开发人凝血因子IX制剂。由于人凝血因子IX在血浆中含量少，不稳定、易分解，且FII、FVII、人凝血因子IX、FX具有相似的理化性质等，因而纯化人凝血因子IX的难度较大。早期的人凝血因子IX制剂均为人凝血因子IX的浓缩物，即凝血酶原复合物(PCC)。这类制剂的人凝血因子IX比活性一般在0.7～1.0IU/mg，除含人凝血因子IX外还含有其他维生素K依赖因子II、VII、X和蛋白C、蛋白S等杂蛋白。大剂量反复使用此类制剂将激活FVIIa、人凝血因子IXa、FXa和过量的FII、FX及磷脂，有引起广泛性静脉血栓的可能或产生弥散性血管内凝血的危险，因此一般输注该药时需在医院注射，需留院观察以防止意外发生。而且由于溶血性的影响，该药复溶后的浓度低，一般只有20IU/ml，临床用药输注时间通常都在1小时以上。为降低凝血酶原复合物的副作用，随着蛋白分离纯化技术的提高，20世纪90年代开始研制生产高纯的人凝血因子IX制剂，这类制剂去除了FII、FVII、FX等杂蛋白，人凝血因子IX比活性一般在50～200IU/mg。可避免由于其他凝血因子活化诱发的血栓类副反应，致血栓副作用明显减少，是迄今治疗乙型血友病的最佳选择。

人凝血因子IX在分离纯化过程中，存在蛋白结构不稳定易析出的问题。

为了解决这个问题，国外的部分上市产品，比如Grifols生产的AlphaNine 贝赋的重组产品Ben人凝血因子IX、Biotest的通常会配备过滤装置，以除去产品复溶后可能产生的蛋白析出物。此举使得人凝血因子IX产品使用较为不便；且经过滤后的溶液，其人凝血因子IX的效价会降低。

使用保护剂也是一种解决该问题的方法。比如CLS生产的BerininMono人凝血因子IX-kedrion生产的Aima人凝血因子产品，中国专利CN 105175486 A公开的人凝血因子IX试制品，都添加了比如肝素钠、AT-III保护剂中的一种或两种。而肝素钠的加入可能给人凝血因子IX产品带入肝素钠过敏风险，增加出血风险；AT-III则可能使人出现口干、视力模糊、头昏、面红、心悸、疲乏甚至精神失常等症状。

同样因为人凝血因子IX蛋白结构不稳定易析出的原因，传统人凝血因子IX制备工艺通常只允许血浆吸附后产生的中间品冰冻保存，而不能将配制前的人凝血因子IX中间品冻存后合批以制备原液，同时由于层析柱纯化规模的限制，通常会导致每批次冻干的产品数量少，冻干批次多，生产成本高。

发明内容

为了解决现有产品容易析出的问题，以及因此引发的一系列次生问题，本发明提供了一种人凝血因子IX的制备方法及其制剂。

本发明首先提供了一种人凝血因子IX原液的制备方法，包括如下步骤：

(1)血浆去除冷沉淀；

(2)阴离子交换层析纯化：使用凝胶吸附如步骤(1)得到的去冷沉淀血浆，洗涤缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱收集凝血因子IX粗提液；

(3)病毒灭活；