[发明专利]一种人凝血因子IX的制备方法

权利要求书

1.一种人凝血因子IX原液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)血浆去除冷沉淀；

(2)阴离子交换层析纯化：使用DEAE Sepharose A50凝胶吸附如步骤(1)得到的去冷沉淀血浆，洗涤缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱收集凝血因子IX粗提液；

(3)病毒灭活；

(4)阴离子交换层析纯化：用水稀释病毒灭活后溶液，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，洗涤缓冲液洗涤层析柱，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；所述层析柱为FractogelEMD DMAE、DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、ToyopearlDEAE、Fractogel EMD Amino650M或TOYOPEARL Amino-650M；

(5)肝素亲和层析纯化：稀释或超滤透析步骤(4)的洗脱液，使其氯化钠浓度低于本步骤洗涤缓冲液氯化钠浓度，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，洗涤缓冲液洗涤层析柱，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；所述层析柱为Heparin Sepharose 6FF、Heparin Sepharose CL6B、Capto Heparin或AF-Heparin HC-650M；

 (6)疏水层析纯化：加电导调节液，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，合并收集流穿和冲洗液；所述层析柱为Toyopearl Phenyl 650M、Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M；

 (7)经超滤、深层过滤，或者深层过滤、超滤，即得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.15-0.25M氯化钠，pH为6.5～7.5；

和/或，步骤(2)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.3-1.5M氯化钠，pH为6.5～7.5；

和/或，步骤(4)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.15-0.35M氯化钠，pH6.0～7.5；

和/或，步骤(4)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.25-0.40M氯化钠，pH为6.0～7.5；

和/或，步骤(4)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.35-0.60M氯化钠，pH为6.5～8.0；

和/或，步骤(5)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐，pH为7.0～7.5；

和/或，步骤(5)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.20-0.35M氯化钠，pH为7.0～7.5；

和/或，步骤(5)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.45～1M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5的混合溶液；

和/或，步骤(6)所述电导调节液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、2.0-2.8M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5；

和/或，步骤(6)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、1.5M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5；

和/或，步骤(7)所述深层过滤使用的是普通滤板；所述超滤的截留分子量为10～30KD。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(4)和/或步骤(5)所述洗脱缓冲液含有0.5M氯化钠；

和/或，步骤(6)的电导调节液含有2.5M氯化钠；

和/或，步骤(6)的平衡缓冲液含有1.5M氯化钠；

和/或，步骤(6)所述电导调节液的添加量与步骤(5)洗脱液体积相同；

和/或，步骤(7)所述的深层过滤是采用含有硅藻土或珍珠岩助滤剂的滤板过滤。

4.一种人凝血因子IX原液的制备方法，其特征在于，其是将权利要求1-3任一所述方法的步骤(3)和步骤(4)交换顺序得到的制备方法。