[发明专利]一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用

说明书

本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用。相比于现有报道，本发明提供的技术方案能够同时分析mRNA和lncRNA，以及snoRNA，也可以分析含有富含GC的重复扩增的RNA模板；此外，建库起始样本量少，所需时间短，偏差更少，适用于检测全细胞、外泌体乃至最新的技术包括HITS‑CLIP/CLIP‑seq、RIP‑seq、ribosome profiling核糖体图谱分析等，减少测序偏差，还可以获得snoRNA和其他结构的非编码RNA的全长序列。

本申请要求了2018年12月28日提交中国专利局的，申请号为201811620297.6，发明名称为“一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及高通量测序及文库构建领域，更具体地，涉及一种高灵敏度外泌体融合基因检测方法及其应用。

背景技术

所有的RNA-seq技术，都需要先进行cDNA合成步骤：利用反转录酶(RT)将RNA转录为DNA，然后进行高通量DNA测序。现有的RNA-seq技术可以大致分为两种：

第一种适用于检测mRNA、lncRNA，用oligo(dT)引物进行反转录，富集poly(A)+RNA；第二种是去除高丰度的rRNA之后，使用随机引物进行反转录。通过反转录得到cDNA产物，然后转化为合适长度的双链DNA，链接到平台特异的测序接头。最广泛使用的技术是使用RNA片段、random hexamer引物，在合成第二链的时候添加dUTP；在加接头之后，含尿嘧啶的第二链会在PCR的过程中通过高保真度的DNA聚合酶被去除，或者被酶促降解，以达到链特异性。

第二种RNA-seq的方法，适用于miRNA和其他小非编码RNA，需要将含有引物结合位点的RNA-seq接头连接到靶RNA的3’或5’末端，然后进行反转录、PCR扩增，构建RNA-seq文库。

逆转录酶(RT)在生物技术中别用于合成RNA的cDNA拷贝用于多种应用，包括RT-PCR和qRT-PCR、cDNA文库的构建、微阵列的探针的制备、以及常规的和下一代RNA测序。

TGIRT，即热稳定内含子II型反转录酶(thermostable group II intron reversetranscriptases,TGIRT)。与传统的逆转录病毒的反转录酶相比，TGIRT酶有着更高的持续合成能力和保真度；TGIRT还有着显著的模板转换活性，无需RNA连接酶就可以在cDNA合成的过程中直接加上RNA-seq的接头。

但是，现有的RNA-seq技术重复性很高，但是仍会因为RNA样本制备、反转录、添加接头的方法不同而出现一定的偏差；此外，因为有很多结构蛋白，比如tRNA、snoRNA，对传统的RNA-seq耐热。

具体来说，现有技术有着以下的局限性：1)不能在同一个RNA-seq反应中同时进行mRNA、lncRNA、小ncRNA测序；2)适用于cDNA合成的逆转录病毒RT酶的相对保真度较低、持续合成能力较低，难以分析RNA序列多态性、高级结构或富集GC的RNA；3)用RNA连接酶或random hexamer引物加接头，会产生偏差。

有鉴于此，有必要提供一种针对中小长度RNA高通量测序的建库方法，偏差更小，保真度更高，能同时检测mRNA、lncRNA和snoRNA，还可以获得其他结构的非编码RNA的全长序列的方法。

发明内容

本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法及其应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供了一种中小长度RNA高通量测序建库方法，包括如下步骤：