[发明专利]安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法

说明书

本发明提供一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，该方法采用蛋白纯化仪，利用反向填料柱对尿液中的葡萄糖醛酸结合物进行一次分离，将分离后的样品溶液分别进LC‑MS，并与标准品溶液的液质检测结果进行对比，并计算目标物样品的纯度。当纯度合格时，则保存，待用；当纯度不合格时，则需要对其进行二次分离，即利用离子交换的原理进一步分离，然后将所得溶液再次经过反相填料柱分离纯化，得到与目标物标准品的质谱行为相似，且其保留时间、离子丰度比误差均在可接受范围内的目标物样品；混合相同的目标物样品溶液，离心浓缩，得到微黄色固体，即目标物纯品。该方法，简化了操作过程，且成本相对较低，具有更广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及葡萄糖醛酸结合物的分离制备技术领域，具体涉及一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法。

背景技术

安定(别名：地西泮，DZ)是苯二氮类中最具有代表性的药物之一，其分子式为C₁₆H₁₃ClN₂O，分子量为284.74。其在体内的代谢，首先进行的是氧化还原，由1位N去甲基形成去甲安定(去甲西泮，DMDZ)，3位C羟基化形成羟基安定(替马西泮，TZ)，二者可进一步生成去甲羟基安定(奥沙西泮，OZ)；其次是结合反应，肝微粒体中的UDP-葡萄糖醛酸转移酶能够使TZ和OZ分别与葡萄糖醛酸结合生成葡萄糖醛酸结合物，即羟基西泮葡萄糖醛酸苷(TG)和去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷(OG)，而后随尿排出体外，具体代谢途径如图1所示。

基于文献《咖啡酸在大鼠体内两个葡萄糖醛酸结合物的分离与鉴定》——中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第41卷第6期2010年6月。

文献中报道的技术，其主要缺点在于制备过程繁琐，制备柱填料昂贵。从样品初始处理开始，该技术方法需要四步纯化过程来得到母体的两个葡萄糖醛酸结合物，且每一步所用的分离柱，不仅需要自行装柱，且填料价格也不便宜，尤其是Sephadex LH-20柱，所以这种方法的适用性不太广泛。

因此，该技术所要解决的问题就是要以尽可能小的成本和尽可能便捷的方法来分离制备生物体(如大鼠、家兔)尿液中的葡萄糖醛酸结合物。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利用制备液相，分离、纯化生物体体液(尿液)中安定代谢物——葡萄糖醛酸结合物的方法，与现有技术相比，该方法简化了操作过程，且成本相对较低，具有更广泛的适用性。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种安定代谢物葡萄糖醛酸结合物的制备方法，以体积份数计，包括以下步骤：

S1、取生物体，空腹灌胃生物体重量×2×LD50剂量的安定，收集生物体尿液样品，并于-20℃下储存，待用；

S2、取1份尿液样品，用3份甲醇溶液提取，振荡、离心，取上清液用氮气吹干，再用1份超纯水复溶，振荡，0.22um水膜过滤，用超纯水稀释100倍后进蛋白纯化仪，利用反向填料柱RESOURCE^TM RPC进行一次分离；

S3、将S2中分离得到的若干样品，分别用液相串联质谱仪进行检测，并与目标物标准品进行对比，定性目标物样品，并计算目标物样品的纯度；

S4、判断S3中的目标物样品的纯度是否合格，当目标物样品的纯度合格时，保存，待用；当目标物样品的纯度不合格时，将不合格的目标物样品依次通过离子交换型制备柱HiTrap^TM Q HP、蛋白纯化仪进行分离，并依照S3方法计算目标物样品纯度；

S5、将S4得到的相同的目标物样品溶液混合后，离心浓缩，得到微黄色固体，即目标物纯品。

进一步，S1中，生物体为家兔，家兔的LD50剂量为129.48mg/kg。