[发明专利]一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用，属于生物技术领域，其源于Lactobacillus parabuchneri的野生型酮还原酶，表现出使底物(例如3‑二甲胺基‑1‑(2‑噻吩基)‑1‑丙酮盐酸盐)向产物(例如S‑3‑二甲胺基‑1‑(2‑噻吩基)‑1‑丙醇)转化速率增加的酮还原酶。所述酮还原酶突变体，与SEQ ID NO.7的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。本发明突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

技术领域

本发明涉及一种酶、生物催化方法及其应用，特别是涉及一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇；(R)特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到；旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用；因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。

度洛西汀是一种药物活性化合物，旨在用于抑郁症和尿失禁的适应症领域；S-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇是一种重要的手性醇，是度洛西汀合成中的组成单元；一些文献和专利中描述了度洛西汀的合成路线；这些合成路线的缺点是先合成产生外消旋醇混合物，需要随后通过与光学活性抗衡离子形成盐，将外消旋物转化成非对映体混合物来拆分外消旋物，然后将非对映体物理分离；由于固体和液体的重复分离，这导致了高的工艺成本，并且由于添加了用于分离的光学活性盐，增加了起始化合物的使用；而本发明的3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙酮的立体定向还原将提供一种较便宜的度洛西汀的途径。

中国专利CN103421854A公布了一种(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的生物制备方法，该方法以3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮或其盐为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇，生物催化剂为酮还原酶(KRED)与葡萄糖脱氢酶的组合，所述的氢供体为葡萄糖；该专利所用的的葡萄糖脱氢酶循环体系为行业内熟知的，关键的酮还原酶序列并未随专利公布，且体系用到的pH为7.0，实际生产中二甲基-3-酮基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺在此pH下会发生消去反应，从而产生例如1-(噻吩-2-基)丙-2-烯-1-酮)等杂质，随后的酶促还原会产生更多额外的副产物，例如1-(噻吩-2-基)丙-1-酮、1-(噻吩-2-基)丙-1-醇和1-(噻吩-2-基)丙-2-醇等。

美国专利US8426178公布了改善性质的工程酮还原酶，还提供了编码工程酮还原酶的多核苷酸、能够表达工程酮还原酶的宿主细胞以及使用工程酮还原酶合成多种手性化合物的方法；工程酮还原酶多肽被优化用于催化N，N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺转化为(S)-N，N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺；该方案使用异丙醇做为辅酶循环方式，但反应同时需要抽滤形成负压以除去反应的副产物丙酮，才能使反应有效进行，在生产放大时会增大操作难度及成本。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种活性增强的酮还原酶突变体，其序列为SEQ ID NO.6，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性增强2-10倍。

一种多核苷酸，其编码由序列为SEQ ID NO.6的酮还原酶重组的多肽。

一种多核苷酸，其序列为SEQ ID NO.5。

一种重组质粒，其包括序列为SEQ ID NO.5的多核苷。

一种宿主细胞，其包含所述的重组质粒。