[发明专利]一种用于进行病毒包装效率检测的方法

说明书

本发明提供了一种检测病毒包装效率的方法，该方法基于病毒成功包装核酸后表面电荷会发生变化，通过检测病毒表面带电荷的相对情况，判断成功包装核酸的病毒颗粒数量，进而计算病毒颗粒包装效率。

技术领域

本发明涉及一种新型的病毒包装效率检测方法，特别是在转基因与基因治疗领域中，用于判断病毒包装外源基因的包装效率。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。相比传统医疗手段，以基因技术为基础的基因治疗手段更具针对性，能够获得较为理想的治疗效果，并能大大减轻患者痛苦，其应用被业内普遍看好。自2012年开始，全球新增基因治疗临床试验754例。其中最引人注目的领域当属利用CAR-T细胞靶向肿瘤相关细胞表面抗原的肿瘤的免疫治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫治疗)。2013年CAR-T治疗被《科学》(Science)杂志评选为“十大科技进展”之首。CAR-T技术现阶段主要用于血液肿瘤的治疗，主要代表是FDA于2017年批准的Kymriah(诺华)和Yescarta(Kite)两款产品。

基因治疗的流程一般是利用基因工程的方法将正常基因插入到病毒载体的DNA上；(2)将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；(3)把重组后的病毒直接注入病人体内，病毒感染病变细胞并将正常基因带到靶细胞中，实现疾病的治疗；或者(1)将正常基因插入到病毒载体的DNA上；(2)将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；(3)获取病人的体细胞，如造血干细胞等，体外培养扩增；(4)用重组后的病毒感染获取的病人细胞，病毒把正常基因导入靶细胞中；(5)对携带正常基因的重组细胞体外培养扩增；(6)将携带正常基因的重组细胞回输到病人体内，实现疾病的治疗。

以上无论哪种方法都会用到载体，目前使用的主要载体包括真核载体和病毒载体等，其中病毒载体的研究更加热门，较常用的病毒载体包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可装载DNA片段容量高达5kb，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。腺病毒(adenovirus)颗粒没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。腺病毒的结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。逆转录病毒，球形，有包膜，80～120nm，含有逆转录酶的单链正链RNA病毒。慢病毒是逆转录病毒科中的亚科，逆转录病毒侵入宿主细胞后以自身RNA为模板，靠逆转录酶形成DNA环化后整合到宿主细胞的染色体中，以原病毒形式在宿主细胞中复制。

在使用病毒包装核酸的时候，并不是所有的病毒都正确完成了包装，往往存在损伤的、无感染能力的病毒，这些“无效”病毒会影响后续的应用，因此病毒包装效率的测定非常重要。在现有的检测体系中，传统的包装效率检测的方法有空斑检测法、稀释荧光计数法、定量PCR法、ELISA法(检测P24蛋白含量)等，其中空斑检测法为金标准，但是这些方法或者费时费力，或者成本高，无法实时反应病毒包装过程中的情况，严重影响了病毒的生产制造工艺的效率。因此，亟需一种可以简单精确的用于病毒包装效率检测的方法。