[发明专利]一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用。本发明所述高产赖氨酸的棒状细菌，具有L‑赖氨酸生产能力并且其细胞内L‑赖氨酸合成途径和/或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子中的至少一种的活性增强。本发明所述高产赖氨酸的棒状细菌通过对赖氨酸生物合成途径或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子的序列进行修饰，使其具有相比内源启动子更高的活性，从而增强起始转录效率，进而提高其产赖氨酸的水平，提高L‑赖氨酸菌株的生产能力。实验表明本发明所述棒状细菌为L‑赖氨酸产率和转化率显著性提高，为L‑赖氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用。

背景技术

赖氨酸(Lysine)的化学名称为2，6-二氨基己酸。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低,且在加工过程中易被破坏而缺乏,故称为第一限制性氨基酸。通常所说的赖氨酸均指L型。L型赖氨酸呈针状晶体，在210℃变暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。

赖氨酸是人类和哺乳动物的必需氨基酸之一，机体不能自身合成，必须从食物中补充。赖氨酸主要存在于动物性食物和豆类中，谷类食物中赖氨酸含量很低。赖氨酸在促进人体生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化、缓解焦虑情绪等方面都具有积极的营养学意义，同时也能促进某些营养素的吸收，能与一些营养素协同作用，更好的发挥各种营养素的生理功能。赖氨酸可以调节人体代谢平衡，赖氨酸为合成肉碱提供结构组分，而肉碱会促使细胞中脂肪酸的合成。向食物中添加少量的赖氨酸，可以刺激胃蛋白酶与胃酸的分泌，提高胃液分泌功效，起到增进食欲促进幼儿生长与发育的作用。赖氨酸还能提高钙的吸收及其在体内的积累，加速骨骼生长。如缺乏赖氨酸，会造成胃液分泌不足而出现厌食、营养性贫血，致使中枢神经受阻、发育不良。赖氨酸在医药上还可作为利尿剂的辅助药物，治疗因血中氯化物减少而引起的铅中毒现象，还可与酸性药物(如水杨酸等)生成盐来减轻不良反应，与蛋氨酸合用则可抑制重症高血压病，还有研究表明，补充赖氨酸能加速疱疹感染的康复并抑制其复发。

L-赖氨酸是世界上第二大氨基酸生产品种，广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。

微生物发酵法生产L-赖氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-赖氨酸最主要的方法。但目前L-赖氨酸的菌种的发酵性能仍较差、L-赖氨酸的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种高产L-赖氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种高产赖氨酸的棒状细菌，具有L-赖氨酸生产能力并且其细胞内L-赖氨酸合成途径和/或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子中的至少一种的活性增强。

本发明通过对赖氨酸生物合成途径或TCA循环回补途径的关键酶的编码基因的启动子的序列进行修饰，使其具有相比内源启动子更高的活性，为RNA聚合酶提供可靠的初始结合位点，从而增强起始转录效率，进而提高其产赖氨酸的水平，从而获得高产L-赖氨酸的基因工程菌。

在本发明中，所述关键酶为天冬氨酸激酶(lysC)或丙酮酸羧化酶(pyc)。

在本发明中，所述活性增强是通过改变启动子-10区及其扩展序列增强启动子活性。

在本发明的实施方案中，所述包含天冬氨酸激酶活性增强启动子的序列如SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18所示；所述包含丙酮酸羧化酶活性增强启动子的序列如SEQ IDNo.19或SEQ ID No.20所示。