[发明专利]一种合成对羟基扁桃酸的方法

说明书

本发明公开了一种合成对羟基扁桃酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段构建了一株双质粒重组菌，共表达丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶和NADH氧化酶基因，将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)。将对羟基苯甲醛和乙醛酸转化为对羟基扁桃酸，并通过NADH氧化酶辅酶再生系统，通过将NADH转化为NAD⁺，使得NAD⁺循环再生，转化能够高效进行。并通过优化底物浓度及比例，优化转化温度和pH，实现了对羟基扁桃酸的高效生产。在30℃、pH7的条件下反应24h，可将30mM的底物对羟基苯甲醛转化为28.5mM的对羟基扁桃酸，转化率可达到95％。

技术领域

本发明涉及一种合成对羟基扁桃酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

对羟基扁桃酸，又称4-羟基扁桃酸，分子式C₈H₈O₄，英文名称4-Hydroxyphenylglycolic acid，别名为2-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid。外观为淡黄色水合物固体，熔点109.5～110.5℃(无水物)。

对羟基扁桃酸是重要的医药、农药和香料的中间体。特别在医药上，对羟基扁桃酸是制备抗高血压新药阿替洛尔(Ateno)的中间体，也是制备广谱抗菌素新药阿莫西林的中间体。对羟基扁桃酸临床用于治疗高血压引起的颈项强痛、头痛、偏头痛、头晕、冠心病、心绞痛及早期神经感觉性耳聋，疗效显著、应用普遍；其次还用于抗高血压新药—阿替洛尔及抗癌药物、抗糖尿病药、抗动脉硬化药、抗过敏药和消炎药、β-受体阻滞药等的合成。此外，对羟基扁桃酸在农药、高分子化合物、光电、生物化学等领域都有特殊的应用。

对羟基扁桃酸的合成方法包括化学合成法和生物合成法，其中(1)-(4)为化学合成法，(5)为生物合成法。

(1)苯酚和乙醛酸在氢氧化钠存在下的缩合反应。该方法具有原料易得、工艺简单、成本低等优点，但是收率偏低。(2)苯酚与三氯乙醛反应，三氯甲基基团水解为羧酸基团。三氯乙醛与苯酚进行电化学反应，再将其水解得到成品。该方法产品质量好，但是三氯乙醛价格偏高。(3)对羟基苯甲醛氰醇水解，要使用剧毒的氰化钠和对羟基苯甲醛，该工艺对环境压力大，逐渐被淘汰。(4)对氨基扁桃酸水解，对氨基苯乙酸经重氨化、水解得到成品。该法环境污染及设备腐蚀严重，对氨基氯苄经腈化、水解同样具有上述缺点。(5)通过在大肠杆菌中过表达对羟基扁桃酸合酶，催化对羟基苯丙酮酸反应生成对羟基扁桃酸，但是底物价格昂贵，成本较高。

因此，提供一种原料易得、工艺简单、成本低、收率高、环保的对羟基扁桃酸，具有广阔的市场应用价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明设计了一种全新的基于C-C键连接的生物法合成对羟基扁桃酸的路径并通过构建单酶表达菌株验证了其有效性，最终通过构建双质粒将编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的基因pdc和苯乙醛脱氢酶(ALDH)基因padA及构成其辅酶循环的NADH氧化酶(NOX)的基因noxE共表达于大肠杆菌BL21中以合成对羟基扁桃酸，并对其中的反应条件进行了优化。

本发明的第一个目的是提供一种生产对羟基扁桃酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述双质粒包括pETDuet-1质粒和pRSFDuet-1质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述pETDuet-1质粒用于表达苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述pRSFDuet-1质粒用于表达丙酮酸脱羧酶。

在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶选自热带假丝酵母(Candidatropicalis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码丙酮酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。