[发明专利]一种食蟹猴淋巴细胞的流式圈门方法

说明书

本发明公开了食蟹猴淋巴细胞的流式圈门方法。该流式圈门方法利用CD45圈出所有淋巴细胞，最大程度圈出了所有的淋巴细胞，并保证了圈出淋巴细胞的纯度；再利用CD4和CD8圈出CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞，尽可能圈出所有的CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞，同时保证了圈出的CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞的纯度；本发明的流式圈门方法不会过度依赖技术人员的经验，保证了检测的一致性，使圈门方式更加合理、客观。

技术领域

本发明属于细胞流式检测领域，具体涉及一种食蟹猴淋巴细胞的流式圈门方法。

背景技术

食蟹猴流式细胞学检测在药物临床前安全评价中的主要作用是评价食蟹猴淋巴细胞功能的变化。目前常规的T淋巴细胞流式圈门方式是通过技术人员的经验先圈出所有淋巴细胞(图1)，再通过CD3/CD4/CD8抗体进行后续操作，技术人员的经验决定了淋巴细胞圈门的质量。

CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原(leukocyte commonantigen,LCA)，CD45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物P56lck和P59fyn上酪氨酸脱磷酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用，CD45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义。

目前最为常见的T淋巴细胞圈门方式是：利用流式细胞仪的前向光FSC和侧向光SSC，将细胞分为大体分为中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞。技术人员依照经验将淋巴细胞圈出后，再通过CD3/CD4/CD8等抗体的荧光进行后续操作。该圈门方式的弊端是门中圈出来的细胞为淋巴细胞，由于检测人员的经验不同，门内淋巴细胞的纯度有区别。特别是当淋巴细胞丰度较低时，会照成淋巴细胞的丢失，对结果产生影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中存在的淋巴细胞圈门时的收率低和主观性导致的准确度低的缺陷，提供一种食蟹猴淋巴细胞的流式圈门方法，利用CD45分子圈出所有白细胞，再通过CD4和CD8圈出T淋巴细胞，最大程度保证T淋巴细胞被识别，改变了常规圈门方式过于依赖检测人员的经验，使检测更加规范化，保证了试验的质量。

为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：一种食蟹猴淋巴细胞的流式圈门方法，包括步骤：通过侧向光和CD45荧光检测经CD45抗体孵育过的食蟹猴全血细胞，圈出食蟹猴全血中的淋巴细胞。

较佳地，所述流式圈门方法还包括用CD4荧光圈出经CD4抗体孵育过的食蟹猴全血中的CD4⁺T淋巴细胞。

较佳地，所述流式圈门方法还包括用CD8荧光圈出经CD8抗体孵育后的食蟹猴全血中的CD8⁺T淋巴细胞。

较佳地，所述孵育的时长为45min。

较佳地，所述流式圈门方法还包括在所述孵育后去除食蟹猴全血中的红细胞。其中，所述除去食蟹猴全血中的红细胞的方法优选用溶血剂孵育。

较佳地，用溶血剂孵育的时长为20min。

较佳地，所述流式圈门方法包括以下步骤：

1)将抗猴CD45抗体、CD4抗体和CD8抗体加入食蟹猴全血，避光孵育；

2)将溶血剂加入经步骤1)处理后的食蟹猴全血；

3)调整流式细胞仪各荧光通道电压，使细胞明显地分为5类，并将该电压设置为模板；用流式细胞仪的侧向光和CD45荧光检测经步骤2)处理后的食蟹猴全血，圈出淋巴细胞；

4)用CD4和CD8的荧光圈出CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞。