[发明专利]一种叶绿体中表达紫杉二烯的重组载体pLD-TS

说明书

本发明属于植物生物工程技术领域，具体涉及一种叶绿体中表达紫杉二烯的重组载体pLD‑TS。该载体制备步骤包括：紫杉二烯合成酶基因TS基因获得、载体构建、转化验证等步骤。该载体在烟草叶绿体中，以烟草叶绿体基因组上trnI和trnA为左右同源序列，利用Prrn启动子调控筛选标记aadA基因，同时利用psbA基因的启动子和5’UTR调控紫杉二烯合成酶基因TS的表达。发明人利用烟草作为异源宿主，借助基因工程手段对紫杉二烯合成途径进行了重构。初步实验结果表明，本申请在烟草叶绿体中高效表达异源合成了紫杉二烯，烟草转化株叶片中紫杉二烯的含量最高可达127.69μg/g，表现出较好的应用前景。

技术领域

本发明属于植物生物工程技术领域，具体涉及一种叶绿体中表达紫杉二烯的重组载体。

背景技术

紫杉醇 (Paclitaxel，商标名为Taxol) 是20世纪70 年代由Wani 等从Taxus brevifolia Nutt树皮中提取出来的具有独特抗癌作用的四环二萜类化合物。从1992 年获得美国FDA 认证以来，紫杉醇以其独特的抗肿瘤机制和显著的抑制肿瘤的作用成为医院临床的首选抗癌药物。目前临床上主要用于晚期乳腺癌、晚期卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤和头颈部肿瘤、上胃肠道癌、小细胞性和非小细胞性肺癌的治疗，对肺癌、大肠癌、脑瘤也都有一定疗效。

迄今为止，用于临床和科学研究的紫杉醇主要通过两种方法获得：一种来自各种红豆杉科的红豆杉属植物树皮的提取物。但红豆杉生长缓慢，树皮中紫杉醇的含量非常低（仅约为干重的万分之一左右）。而由于紫杉醇的大量需求，这一生产方式对红豆杉这一濒临灭绝的宝贵林木资源造成了毁灭性破坏。除此之外，通过全合成、植物细胞或组织培养、植物共生真菌发酵等方法获得紫杉醇也正在进行研究。化学全合成由于工艺复杂、需要25至27步反应，并且由于其中几步反应的收率特别低，因此造成该方法所制备的紫杉醇成本昂贵。而通过植物细胞或组织培养获得紫杉醇方式，也因为产率太低，培养过程复杂不易控制，高产量难以维持等因素难于真正实现产业化。目前紫杉醇及其类似物的制备工艺主要为化学半合成法：利用紫杉醇中间体化合物10-去乙酰巴卡亭III 和巴卡亭III合成紫杉醇，但这两种中间体均需从紫杉树的可再生针叶或细胞培养物中提取。

合成生物学技术在天然化合物的生物合成方面的成功应用为紫杉醇的制备开辟了新的途径。通过合成生物学，可以在遗传背景清晰且遗传操作简单的异源宿主中重建目标产物的生物合成途径，新建的合成途径与宿主原有的代谢途径组成全新的代谢网络，以此来合成特定的目标产物。针对植物活性代谢物的研究，一直是合成生物学领域的热点，其中植物底盘的优势及植物合成生物学的必要性越来越受到重视。其中烟草即是一种重要的植物生物反应器，而且由于烟草具有遗传转化体系成熟、表达水平高、生产成本低、规模化生产能力强、生产周期较短等优点，近年来，已有较多研究人员已经开始尝试在烟草体内通过重组代谢途径合成有价值的复杂代谢物中间体或终产物。基于此，如果能以烟草来制备紫杉醇、或者紫杉醇的相关的前体物，则可望大幅降低紫杉醇的生产成本。

发明内容

紫杉二烯是紫杉醇生物合成途径中的关键前体之一，本发明目的在于提供一种可以在叶绿体中表达紫杉二烯的重组载体pLD-TS，基于此重组载体可以建立一种利用叶绿体生产紫杉二烯的方法，从而为紫杉醇的制备奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种叶绿体中表达紫杉二烯的重组载体pLD-TS，通过如下步骤制备获得：

（1）构建叶绿体表达载体pLD-MCS