[发明专利]一种奈西立肽的肽图分析方法及其应用

说明书

本发明提供一种奈西立肽的肽图分析方法及其应用。所述方法包括如下步骤：将奈西立肽还原并烷基化，加入肽链内切酶进行酶解，之后使用LC‑UV‑MS检测，并根据采集到的肽图数据对所述奈西立肽酶解后形成的多肽片段和/或氨基酸残基进行归属。本发明提供的肽图分析方法，在将奈西立肽进行还原和烷基化之后，使用肽链内切酶将其酶解为多个多肽片段和氨基酸残基，并通过LC‑UV‑MS检测将多肽片段和氨基酸残基与肽图中的峰正确对应，从而达到准确判断奈西立肽的多肽链是否存在缺失、错连或重复等现象。

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种重组多肽类药物的肽图分析，尤其涉及一种奈西立肽的肽图分析方法及其应用。

背景技术

心力衰竭(Heart Failure)是由于心脏结构功能异常而导致心室充盈或射血能力受损的临床综合征，其主要临床表现为活动耐量受限以及液体潴留。传统的心衰治疗方法为“强心、利尿、扩血管”，包括利尿剂、正性肌力药物、β受体阻滞剂、硝酸酯类等药物，虽能缓解心衰患者的临床症状，但疗效有限，且并不能逆转心衰所致的心肌纤维化、心室重构等。故有必要寻找能从根本上治疗心衰的临床新药。

奈西立肽(Nesiritide acetate)是利用重组DNA技术合成的重组人脑利钠肽(recombined human B-type natriuretic peptide,rhBNP)，能够与利钠钛受体结合，具有扩血管、利尿的作用，能明显改善心衰患者的血流动力学指标，逆转心室重构，从而缓解临床症状，降低住院率及死亡率。

奈西立肽与心室肌分泌的天然利钠肽具有相同的32个氨基酸序列，在其第10和第26个氨基酸(均为半胱氨酸)之间由一个二硫键联接，构成了一个含17个氨基酸的环。

CN103275207A公开了一种制备奈西立肽的方法，其操作简单、成本低、制备周期短和/或总收率高(25％)，有利于大规模生产。所述制备奈西立肽的方法包括：制备5个片段，将所述片段依次偶联得到线型奈西立肽，然后经氧化得到奈西立肽，所述方法任选地包括纯化奈西立肽的步骤。然而，制备得到的奈西立肽需要经过检测，确认其肽链的排列结构与理论结构相同才能应用于临床治疗。目前，针对这类重组蛋白质或多肽药物的鉴定方法主要为肽图分析。

肽图(Peptide Mapping)是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶(一般为肽链内切酶)作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。肽图分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。生物工程产品的质量控制是保障产品质量的关键，其中，肽图是研究蛋白质一级结构的一种重要的分析方法。胰蛋白酶(Trypsin)是一种常见的肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。对于重组的多肽类药物的肽图检查，我国药典中收录了两种方法，分别为胰蛋白酶裂解-反向液相色谱法和溴化氰裂解法。

目前对于奈西立肽的肽图分析中，通常使用胰蛋白酶裂解-反向液相色谱法对其进行分析，分析结束后还需要将奈西立肽分解后的片段进行收集，然而此过程较为耗时。在对液相色谱图的峰进行归属时，常认为部分小分子片段(极性大)在相对较大分子(极性小)的后边出峰，然而，根据反相色谱的保留机理，极性大的片段应该在反相色谱柱上保留较弱，会靠前出峰，所以在片段归属方面现有技术的分析存在偏差。

因此，需要提供一种新的准确度较高、且步骤较为简单的鉴定方法对奈西立肽进行检测，从而实现对奈西立肽肽图的准确分析。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种奈西立肽的肽图分析方法，使用此方法可以较为简单省时并且准确地将奈西立肽酶解后的片段与肽图中的峰进行对应，极性大的小分子片段归属于肽图中靠前的峰，极性小的大分子片段归属于肽图中靠后的峰，所得分析结果更加准确。为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种奈西立肽的肽图分析方法，包括如下步骤：