[发明专利]一种蛋白动态表达调控系统及其在莽草酸生产中的应用

说明书

本发明公开了一种蛋白动态表达调控系统，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段，利用生长期启动子和降解标签的特性设计构建出不需要借助人为控制和外源添加诱导剂的蛋白动态表达调控系统。引入该动态表达调控系统构建的生产莽草酸基因工程菌，能够实现动态调控莽草酸激酶的丰度变化，在无机盐培养基中，在不添加诱导剂和芳香族氨基酸条件下利用大肠杆菌生产莽草酸的能力，生产的莽草酸产量最高可达31g/L，是目前相同条件下已知报道的最高水平。

技术领域

本发明涉及一种蛋白动态表达调控系统及其应用，具体涉及一种由启动子和降解标签组合控制的蛋白动态表达调控系统及其在莽草酸生产中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

为满足全球范围内对可持续发展的需求。过去十年，微生物细胞工厂是生产高价值化合物(如生物燃料，可再生材料和医药中间体)的重要工具。代谢工程改造微生物细胞工厂是调节代谢流的重要手段。目前研究者已经尝试通过静态调控和动态调控两种策略来实现这一目标。使用传统基因敲除和基因过表达等静态调控策略可能会损害细胞活力并降低细胞的发酵参数，如生产强度、得率和产量。相反，动态调控策略正在成为提高微生物合成效率的新策略。它可以平衡微生物的内源调控网络和人工合成基因网络，实现细胞生长和产品合成的解偶联。

目前的动态调控主要在转录和翻译后水平。转录水平的动态调控广泛用于代谢工程中以控制代谢流量。基于响应信号，转录水平的动态调控分为三类：环境(如温度，光和pH)依赖型回路、细胞外(如小分子自诱导物)回路和细胞内(如细胞生理状态和胞内代谢物)回路。这些转录水平的动态调控方法在改变代谢流量、减少有毒中间体对细胞损伤、平衡细胞生长和化学合成方面取得了许多进展。但是，仅使用转录水平调控，调控响应时间很长，代谢调控精度差。另一种是翻译后水平的动态调控。该动态调控方法采用两种策略，一种策略是通过使用C末端降解标签控制靶蛋白降解来降低内源性通路通量，最终使目标蛋白活性降低56％(Metab Eng 2015,28,104.)；另一种策略是使用蛋白酶切除含有降解标签序列，控制靶蛋白的表达来增加外源途径的代谢通量，从而实现在细胞生长和PHB生产之间的状态切换(ACS Synth Biol 2018,7(11),2686.)。但是上述两种策略中靶蛋白处于连续降解和连续合成的状态，增加了细胞的能量消耗和负荷。

为了解决上述缺点，最近提出了一种结合转录水平调节和蛋白水平调节的新策略。Gupta通过结合群体感应系统QS和蛋白质降解标签构建了一个独立于代谢路径的遗传回路，用于调节代谢通量并实现化学合成(Nat Biotechnol 2017,35(3),273.)。然而，该系统需要引入含有外源蛋白的QS，且目前仅在基因组水平进行了有效性验证。在最近的一项研究(Nat Commun 2019,10(1),3751,CN201811493330.3也披露了同样的内容)中，研究者构建了一个依赖启动子控制和蛋白质酶参与的动态控制开关，以增加莽草酸的产量，但为了实现动态调控，该系统需要在原核细胞中表达可溶性较差的病毒蛋白酶，且需要对靶蛋白的N末端进行蛋白酶识别位点和降解子的融合，这种分子操作可能会影响靶蛋白的活性与表达水平。总体而言，目前的动态调控，普遍需要借助响应代谢物浓度的转录因子、响应细胞密度的效应蛋白、异源蛋白酶等异源蛋白的参与。这些系统的设计较为复杂，在应用上述设计时，需要精细优化系统，工作量较大。因此，如何设计出一种更为精简有效的动态表达调控系统是本领域技术人员亟需解决的难题。

莽草酸是制备抗流感药物达菲的前体药，在大肠杆菌中由分支酸路径合成。传统的莽草酸生产方法是敲除菌株的莽草酸激酶I和II，以阻断莽草酸到莽草酸-3-磷酸的合成通量，实现莽草酸的积累。然而，莽草酸-3-磷酸的下游产物包含大肠杆菌生长必需的芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,直接阻断莽草酸-3-磷酸的合成，将使菌株在无机盐培养基中出现生长缺陷。为了促进菌株生长，现有技术需要在培养基中添加价格昂贵的芳香族氨基酸或者诱导剂。因此，提供一种在简单培养基中高产莽草酸的方法，控制莽草酸激酶在发酵前期表达，发酵后期关闭，实现细胞生长与产物合成解偶联，对于工业制备莽草酸具有重要的意义。

发明内容