[发明专利]总胆汁酸检测试剂盒及方法

说明书

本发明涉及TBA检测试剂盒，其包括第一试剂，所述第一试剂含有Thio‑NAD；第二试剂，所述第二试剂含有NADH、3α‑HSD、非离子表面活性剂和抗生素类防腐剂。通过非离子表面活性剂和抗生素类表面活性剂的组合，本发明延长了TBA循环酶法检测试剂的保存时长且不易造成试剂稳定性的下降。此外，本发明还涉及检测TBA的方法。

技术领域

本发明涉及总胆汁酸检测领域，具体涉及基于循环酶法检测胆汁酸的试剂。

背景技术

总胆汁酸(Total bile acids,TBA)是胆甾醇在肝内分解及肠肝循环中胆甾酸代谢产物的总称，是机体内胆固醇代谢的主要终产物，也是胆汁的重要成分，在脂肪代谢中起着重要作用。正常人的血液中，TBA水平极微，而当肝细胞中TBA代谢异常时，TBA反流入血，从而发生血清中TBA升高的现象。因此，可将血清中TBA水平与多项肝酶学指标结合，可以对慢性肝病、肝硬化、酒精性肝病以及胆汁淤积的发生、进展和预后进行辅助判断。

目前临床使用的TBA检测试剂盒有酶比色法和循环酶法。其中酶比色法的反应原理为3α-羟基胆汁酸在NAD⁺的存在下由3α-羟类固醇脱氢酶催化生成3-酮基胆汁酸和NADH，NADH与四唑氮蓝(NBT)在黄递酶作用下生成稳定蓝色染料，随后通过比色测定确定总胆汁酸浓度。然而，一方面，酶比色法易受到血清中乳酸脱氢酶等物质的干扰；另一方面，大多数自动分析仪上无法去除样本空白的干扰。

循环酶法是另一种常用的TBA检测方法，其避免了酶比色法存在的上述缺陷，能够实现便捷、准确度高的检测。循环酶法的反应原理为胆汁酸会被3-羟甾醇脱氢(3-HSD)以及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)氧化，生成3-酮类固醇以及β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)。而生成的3-酮类固醇会在3-HSD及NADH存在下，生成胆汁酸及NAD。按照上述循环，微量的胆汁酸量被逐步放大，通过测定单位时间内生成的Thio-NADH在405nm处的吸光度变化，可计算出胆汁酸的浓度。

循环酶法的TBA试剂中含有大量NADH，为了维持NADH的稳定性需将pH调至碱性，在此pH条件下，生化试剂中常用防腐剂的防腐效果将减弱甚至失去防腐效果，从而大大缩短了试剂的保存时长。即便少数防腐剂在此pH条件下防腐效果较好，但其对酶活影响较大，会造成试剂稳定性下降，不宜用于在基于循环酶法的TBA检测体系中。

据此，在TBA检测领域，存在着在延长含NADH试剂的保存时长的同时保持反应体系酶活的强烈需求。

发明内容

如上文所述，循环酶法是一种常用的、能准确血清中TBA的方法，其中NADH是循环酶法中必要的反应成分。由于NADH需要在碱性条件下，导致大多数常见的防腐剂无法很好地发挥作用。虽然一些防腐剂在碱性条件下仍具有防腐效果，但会影响循环酶法反应体系中酶的活性，造成试剂稳定性的下降。也就是说，在目前的基于循环酶法的TBA检测试剂中，一方面，难以获得优异的试剂的保存效果，另一方面，优异的保存效果与试剂的稳定性无法兼顾。

为解决上述问题，本发明中对循环酶法的TBA检测试剂进行了研究，意外地发现将非离子表面活性剂与抗生素类防腐剂同时加入到含NADH的TBA检测试剂中，能够兼顾保存效果与体系稳定性的试剂盒，从而完成本发明。

据此，在第一方面，本发明提供了一种试剂盒，包括：

第一试剂，其含有Thio-NAD、pH调节剂和防腐剂，任选地，所述pH调节剂将pH调节至3～4.5；

第二试剂，其含有NADH、3α-HSD、缓冲液、非离子表面活性剂和抗生素类防腐剂，任选地，所述缓冲液的pH为8～10。

在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂为Tween系列，例如Tween20、Tween60和Tween80等中的一种或更多种。