[发明专利]一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法

说明书

本发明提供了一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括如下步骤：1）收获液制备；2）病毒灭活；3）超滤浓缩；4）浓缩后纯化一；5）纯化二；6）病毒裂解；7）裂解后纯化三；8）半成品制备；9）成品制备。本发明具有如下技术效果：本发明利用经过优化的三步纯化工艺制备的四价流感病毒裂解疫苗样品中具有更低的卵清蛋白含量，更低的杂蛋白含量以及高纯度的血凝素抗原，保证了四价流感病毒裂解疫苗的不良反应更低，疫苗的免疫效果更好，疫苗的安全性更高。

技术领域

本发明涉及一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，属于疫苗技术领域。

背景技术

流行性感冒病毒，属正粘病毒科的代表，简称流感病毒，流感病毒形态呈球形，少数呈丝状，其直径在80至120纳米之间，流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。

2018年之前，我国已上市季节性流感疫苗以流感病毒裂解疫苗为主导，且全部为三价疫苗，上市的三价流感疫苗含两种A型和一种B型毒株(Yamagata系或者Victoria系)，由于B型病毒Yamagata系和Victoria系之间的交叉保护作用很弱，含一种B型的三价流感疫苗对另一谱系B型病毒保护效果有限。

2018年，四价流感病毒裂解疫苗在我国获批上市。四价流感病毒裂解疫苗包含甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系(By)、乙型Victoria系(Bv)四种流感病毒抗原成分，比之前的三价流感病毒裂解疫苗多了乙型Yamagata系(By)流感病毒抗原成分。四价流感病毒裂解疫苗包含上述两种甲型和两种乙型共四种流感病毒抗原成分，可涵盖更多的流感流行型别，将有效预防和控制流感疫情。

目前国内流感病毒裂解疫苗均采用鸡胚工艺生产，疫苗纯化工艺主要有超速区带离心或凝胶(柱)层析法。目前上市的流感病毒裂解疫苗大多采用两步纯化工艺(超速区带离心和凝胶(柱)层析法组合，或两次超速区带离心法组合)，两步纯化工艺生产的疫苗抗原纯度相对较低，而且卵清蛋白(流感疫苗中的主要过敏原)相对较高。

另外，现有的流感裂解疫苗的免疫效果和安全性还有提高的空间。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法。在目前三价和四价流感疫苗的基础上，通过优化生产工艺，制备免疫效果更好、安全性更高的包括两个B型流感病毒的四价流感病毒裂解疫苗。

本发明的技术方案如下：

一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)收获液制备：采用世界卫生组织推荐的并经国务院药品监督管理部门批准的H1N1、H3N2、B1(B/Victoria系)和B2(B/Yamagata系)四种流行性感冒(简称流感)病毒株分别接种9-11日龄健康鸡胚，经3335℃、4872小时培养，28℃冷胚后收获病毒液；

2)病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活；

3)超滤浓缩：灭活后的收获液采用1000KD超滤膜包进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；

4)浓缩后纯化一：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化，在静止时以100±20ml/min的流速从连续流区带离心机转子底部泵入55％的蔗糖溶液1600ml，确认真空度小于40Pa(1mTorr＝0.133Pa)，设置转速为35000rpm；当达到35000rpm时以300±50ml/min，由下向上连续泵入浓缩液，每台离心机一次连续上样量不超过100L浓缩液；进样完毕，以100±20ml/min的速度泵入pH7.2PBS缓冲液，35000rpm离心45min后，设定转速至0rpm；待离心机转子静止，开启蠕动泵，控制泵速在100±50ml/min，从底部收样；