[发明专利]一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)收获液制备：采用世界卫生组织推荐的并经国务院药品监督管理部门批准的H1N1、H3N2、B1(B/Victoria系)和B2(B/Yamagata系)四种流行性感冒病毒株分别接种9-11日龄健康鸡胚，经小时培养，冷胚后收获病毒液；

2)病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活；

3)超滤浓缩：灭活后的收获液采用1000KD超滤膜包进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；

4)浓缩后纯化一：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化，在静止时以100±20ml/min的流速从连续流区带离心机转子底部泵入55％的蔗糖溶液1600ml，确认真空度小于40Pa，设置转速为35000rpm；当达到35000rpm时以300±50ml/min，由下向上连续泵入浓缩液，每台离心机一次连续上样量不超过100L浓缩液；进样完毕，以100±20ml/min的速度泵入pH7.2 PBS缓冲液，35000rpm离心45min后，设定转速至0rpm；待离心机转子静止，开启蠕动泵，控制泵速在100±50ml/min，从底部收样；

5)纯化二：采用300KD超滤膜包超滤除糖后，再采用柱层析法纯化，介质为Sepharose-4FF凝胶，每批等分成两个部分分次上样进行层析纯化，每次上样量不超过柱体积的8％，上样速度80～350ml/min，进样后泵入pH7.2PBS溶液进行洗脱，洗脱速度353～424ml/min，用280nm紫外检测仪收集病毒峰，层析纯化后收集的纯化液取样进行蛋白质含量检测，控制蛋白质含量不高于1200μg/ml；

6)病毒裂解：病毒纯化液加入裂解剂Triton X-100进行病毒裂解，添加终浓度为0.5％Triton X-100，置于恒温摇床中进行裂解16～18小时，得到病毒裂解液；

7)裂解后纯化三：病毒裂解液再次经过蔗糖密度梯度离心纯化，CP70区带离心机进入3000rpm区带模式后，从离心机加样器边孔依次进样泵入：pH7.2PBS溶液、裂解后病毒液、30％蔗糖溶液、55％蔗糖溶液，上样速度不超过300ml/min；进样完毕，设置离心机转速30000rpm、离心温度15℃、离心时间3小时，区带离心后收集蔗糖浓度为1％～42％范围内的液段；然后用超滤法去除蔗糖，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤，即为单价原液；

8)半成品制备：根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制，血凝素配制量在范围内，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释，即为半成品；

9)成品制备：半成品经过滤分装、包装、检定合格即为成品，用于预防四种流行性感冒病毒引起的流行性感冒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤4)中，连续流区带离心机为eKII连续流超速区带离心机。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤5)中，采用BPG300/950装填Sepharose-4FF快速流凝胶介质。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤7)中，区带离心机采用CP70区带离心机。