[发明专利]一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法

说明书

本申请公开了一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法。本申请的磁珠法核酸提取试剂盒包括细胞裂解液、磁珠和洗涤液，其中，细胞裂解液中含有异硫氰酸胍、Triton X‑100、3‑[3‑(胆酰胺丙基)二甲氨基]‑1‑丙磺酸和N‑月桂酰肌氨酸钠。本申请的磁珠法核酸提取试剂盒，通过对裂解缓冲液的组分进行优化，可以快速、充分的裂解细胞、变性蛋白质、使蛋白质与核酸有效分离，释放出核酸；提高了细胞裂解液的工作效率，缩短了核酸提取的时间。

技术领域

本申请涉及核酸提取领域，特别是涉及一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法。

背景技术

核酸是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。随着分子生物学检测技术的飞速发展，基于核酸信息的分子诊断技术成为有效的疾病诊断的新型临床手段和思路，特别是在感染性疾病、肿瘤和遗传性疾病领域。新发展的感染性疾病分子诊断技术不仅有效的弥补了传统方法的不足，还为临床医生提供了细菌、真菌或病毒的感染信息以及病原体的耐药基因结果，甚至病原体的同源性分析。

基于核酸信息的分子诊断技术的发展也对核酸提取和纯化有了更高的要求，临床上病原体分子检测的有效进行除了需要得到高质量的核酸分子外，快速高效也是分子检测在临床应用的一个重要因素。比如临床上对于一些急性感染患者，快速准确的确定病原是治疗最关键的环节。此外，对于一些急性病毒引起的疫情，有时需要现场检测；对于一些特殊的部门和岗位也需要快速准确的诊断，比如海关执法人员需要快速诊断出发热旅客是否由特定的病毒或者病菌引起，这个过程往往要求在0.5～2小时内完成，否则可能会给旅客带来很大的不便，甚至可能会对其他旅客造成安全隐患。

目前市面上针对于血清、唾液、咽拭子等临床样品的微生物核酸提取方法主要采用磁珠法、吸附柱法以及快速提取核酸的Chelex100煮沸法。其中磁珠法主要是先采用溶菌酶、蛋白酶K等生物活性酶孵育结合裂解液破壁变性的方式进行核酸分离，再采用磁珠进行核酸纯化等操作；该方法可以结合自动化提取设备实现自动化操作，减少操作人员带来的污染和操作误差，提取得到的核酸得率高、纯度好；但是提取步骤繁琐、操作周期长，整个提取需要1.5小时～3小时，甚至更长者需要过夜提取，很难满足快速检测的需求。

并且，现有的磁珠法核酸提取试剂盒还存在以下缺点：第一，在裂解环节通常需要采用溶菌酶、蛋白酶K等生物活性酶再结合盐酸胍或异硫氰酸胍等胍盐等强力蛋白质变性剂，在56℃～65℃条件下孵育，破坏样本组织中的蛋白质和其他成分，释放出核酸，再通过添加一定比例的异丙醇或无水乙醇等沉淀核酸；该过程一般操作时间在25分钟～1小时，甚至过夜孵育，很难满足快速检测或现场检测的需求。第二，磁珠吸附后，通常需要采用两种洗涤液进行两步法洗涤，首先采用含有一定比例无水乙醇或异丙醇等醇类的高盐试剂洗涤液进行洗涤，去除磁珠上吸附的非特异性杂蛋白，再通过第二步高比例无水乙醇低盐试剂的洗涤液进行第二次洗涤，去除磁珠的盐离子；并且，洗涤完成后，由于洗涤有使用乙醇等PCR抑制剂，会影响后续的PCR扩增，因此，往往需要在洗脱前进行5～10分钟的开盖放置操作，使乙醇挥发去除，这样操作不仅延长了提取操作时间，并且直接开盖放置暴露在空气中容易导致样本间的交叉污染。第三，现有的磁珠法提取核酸，通常需要将磁珠吸附的核酸洗脱下来，然后吸取上清液，去除磁珠，再采用溶于上清液的核酸进行PCR扩增，这个过程难免会造成核酸损失，特别是吸取上清液和洗脱的核酸溶液转移过程中会有部分核酸被遗弃，这不利于微量样品的核酸提取和检测，也间接降低了检测灵敏度。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒，包括细胞裂解液、磁珠和洗涤液，其中，细胞裂解液中含有异硫氰酸胍、Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠。