[发明专利]一种纳米抗体制备方法

说明书

本发明公开了一种纳米抗体制备方法，通过将目的抗原免疫动物，获得免疫后的动物外周血单个核细胞，并富集B细胞，用FITC荧光标记目的抗原，使用半固体培养基培养细胞，形成独立单个B细胞克隆，挑选分泌阳性重链抗体的单个B细胞克隆，提取阳性B细胞总RNA，逆转录成cDNA，并进行VHH片段扩增及测序，纳米抗体的重组表达和活性鉴定。本发明的方法可以直接观察并挑选分泌VHH抗体的阳性B细胞克隆，通过分泌的抗体形成荧光信号，更符合B细胞抗体分泌功能特性。本发明方法筛选制备的纳米抗体具有分子量小、稳定性强、亲和力高、可溶性好、容易表达等优势，用途广泛。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种纳米抗体制备方法，可快速挑选和制备抗原特异性纳米抗体。

背景技术

哺乳动物(包括人)的抗体一般由两条重链与两条轻链组成，重链的Fc区域能保证抗体在体内有较长的半衰期。传统的抗体药物具有一些不可避免的缺点：分子较大，难以穿透组织和细胞，尤其是血脑屏障等生理屏障；制备、保存和运输过程中容易聚集、沉淀；容易引发抗抗体反应；筛选到具有生物活性的高亲和力抗体几率较低。1993年，比利时科学家Hamers-Casterman等在骆驼和羊驼体内发现一种新的抗体，这种抗体只有传统抗体的1/10，却完全具备了抗体活性，即能够有效识别靶向抗原，并且此类抗体具有能够穿透组织，到达病变位置的能力，而且这种抗体稳定性极佳，能够耐受较强的温度和酸碱性刺激，免疫原性低，亲和力高，而且容易进行体外化学和生物学修饰，是良好的抗体药物。这种抗体现在被称为纳米抗体(nanobody)，纳米抗体同样含有3个CDR，其中CDR3对亲和力起到主要作用。与人抗体VH相比，CDR3更长，可以形成凸环结构，能够深入抗原内部更好的结合抗原，因而亲和力更高。此外，VHH的FR2的疏水残基被亲水残基取代，水溶性更好，不易形成聚集体。所以，纳米抗体的广泛应用在生物医药领域将带来一场巨大变革。

相较于普通抗体，纳米抗体具有以下优势：

1)针对不同种类的抗原，抗体制备的成功率较高，亲和力可达到nM甚至pM级别；

2)通过基因工程进行抗体组合，不仅能够提高亲和力和特异性，而且能识别更多的抗原；

3)可与其他技术联合做新型治疗方法；

4)可用于不同的给药方式，包括吸入、口服、滴眼等；

5)独特的稳定性，包括热稳定性和对酸碱的耐受性；

6)生产成本相对较低，可以采用原核培养(细菌或酵母)的生产体系，高浓度时不易聚集。

纳米抗体具有广阔的应用范围。在药物治疗领域，Fc域的缺失使得纳米抗体安全性得以提高，在作为纯粹的免疫调节分子时，纳米抗体的有效性也会提高。纳米抗体的小分子量，使得其容易达到渗透到某些难以达到的癌变组织，分布均一性更好。在抗感染方面，纳米抗体可以通过阻断病毒-细胞结合、病毒进入、病毒包被等过程，防止病毒的扩散。血脑屏障是中枢神经系统疾病药物开发的一个重大障碍，一些纳米抗体可以穿透血药屏障，使纳米抗体在治疗神经系统疾病具有独特的潜力。此外，纳米抗体在基础研究领域、生物成像和生物学检测等领域均具有独特的应用价值。