[发明专利]一种纳米抗体制备方法

权利要求书

1.一种纳米抗体制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)用目的抗原免疫动物；

(2)获得目的抗原免疫前和免疫后的动物外周血单个核细胞(PBMC)，并富集B细胞；

(3)用FITC荧光标记抗原；

(4)使用CloneMedia^TM半固体培养基培养细胞，形成独立单个B细胞克隆；

(5)挑选分泌阳性重链抗体的单个B细胞克隆；

(6)提取阳性B细胞总RNA，逆转录成cDNA，并进行VHH片段扩增及测序；

(7)纳米抗体的重组表达；

(8)纳米抗体抗目的抗原的活性鉴定，用ELISA方法鉴定纯化的纳米抗体活性。

2.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(1)将目的抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照6-7μg/kg剂量在动物背部皮下多点注射方式免疫动物，共免疫4次，每次间隔2周。

3.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述目的抗原可以通过提取天然抗原获得，或者通过同源重组的方式，由真核或原核细胞表达提纯获得，或者通过其它方式获得。

4.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(2)取免疫前动物抗凝外周血10mL，通过密度梯度离心法分离PBMC，用CD138抗体包被的免疫磁珠从PBMC中分选B细胞，将B细胞置于细胞冻存液中，液氮保存备用，用目的抗原免疫动物，于免疫程序结束时取动物抗凝外周血10mL，通过密度梯度离心法分离PBMC，并富集B细胞。

5.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，步骤(3)使用AlexaFluor^TM488Antibody Labeling Kit试剂盒对步骤(1)中目的抗原进行绿色荧光标记。

6.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，所述步骤(4)向CloneMedia^TM半固体培养基添加步骤三所标记的目的抗原0.1-10μg/L、PE标记的抗动物IgG轻链抗体、R848 2.5μg/mL和IL-2 1000U/mL，混匀，加入富集的B细胞，细胞密度1000个/mL，混匀后铺6孔板，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱中培养6天。

7.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，所述步骤(5)将步骤(4)中培养的B细胞置于ClonePix^TM细胞单克隆挑选仪器中，对培养的细胞进行拍照，再用ClonePix^TMFL Fusion分析软件分析单个B细胞克隆的平均荧光强度、克隆大小、克隆密集程度及克隆间距，挑选平均荧光强度强、克隆大小适中、相对独立的单个B细胞克隆，置于96孔板中。

8.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，所述步骤(6)用Qiangen^TMmiRNeasy Micro Kit提取步骤(5)中挑选的单个B细胞克隆总RNA，并使用Qiangen^TMOneStep RT-PCR Kit一步法扩增VHH片段，所用上下游引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，将扩增产物送测序公司进行基因测序。

9.根据权利要求1所述的一种纳米抗体制备方法，其特征在于，所述步骤(7)将表达载体pET30a(+)和VHH片段用Not I和Ned I酶双酶切，跑胶后回收片段，将载体与片段连接，转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，并用1mmol/LIPTG诱导蛋白表达，进行抗体亲和层析纯化，-20℃保存备用。