[发明专利]一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用

说明书

本发明公开了一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用。所述食品级植物乳杆菌表达系统包含食品级宿主植物乳杆菌NZ1210、食品级表达载体pLP4180；所述食品级宿主植物乳杆菌NZ1210是采用同源重组技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的lacA和lacM基因而获得，丧失利用乳糖的能力；所述表达系统在异源蛋白表达中应用，表达效果显著；所述表达系统为食品级表达系统，其DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记，可以直接应用于酸奶发酵中。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用。

背景技术

乳酸菌是一类能够发酵碳水化合产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的通称，包括乳球菌，乳杆菌，双歧杆菌和链球菌等。他们被广泛应用于食品发酵行业，如牛奶，肉类，蔬菜和谷物中。此外，乳酸菌菌株是用作益生菌的最常见微生物。乳酸菌通常被认为是安全的，而基因工程技术在改善现有菌株或开发新菌株方面的应用是活跃的研究领域。基因技术允许通过引入新基因或修饰其代谢功能对菌株进行修饰。这些变化可以改善食品技术并促进人体健康。传统上，抗生素抗性基因通常被用作实验室研究中载体的选择标记。然而，出于法律和道德原因，由于抗生素抗性的基因的转移，在食品或临床应用中不能采取这种方法。因此，需要使用其它替代的选择标记。

基于染色体基因中特定突变的互补是获得稳定和可选择的宿主/载体系统的一种重要方法，该基因编码特定代谢途径中的必要步骤或赋予生物体或表型某些特性。第一步，构建可行的敲除突变体，在宿主染色体中携带所需的基因缺失。第二步包含携带相容性互补的表达载体的构建。其优点是可以在发酵系统中保持选择性压力，例如在发酵牛奶中可以不添加任何补充剂。植物乳杆菌代谢背景清晰，它不仅能够利用葡萄糖，还可以利用乳糖作为碳源进行良好生长。其乳糖代谢依赖于体内的β-半乳糖苷酶LacA和LacLM，其中LacA由基因lacA(2052bp)所编码，LacLM是由lacL(1881bp)和lacM(960bp)基因编码蛋白所形成的异源二聚体。因此拟选择lacM基因作为筛选标记，开发其为植物乳杆菌的食品级表达系统，为乳酸菌在功能性酸奶领域的研究提供一种有效安全的手段。

中国文献《“食品级”乳酸菌表达载体系统的研究进展》(郝凤奇、杨桂连、叶丽萍等，中国预防兽医学报，第30卷第10期，2008年10月)公开了乳糖选择标记，MacCormick等将完整乳糖操纵子整合到一株敲除质粒的乳酸乳球MG5276的染色体上，并通过双交换使lacF基因失活，结果该菌株不能利用乳糖(Lac-)，然后再将克隆有lacF基因的质粒转到上述菌株中，该菌则恢复了利用乳糖的能力(Lac+)。

乳糖在乳酸乳球菌中的代谢，首先通过磷酸转移酶系统将胞外的乳糖磷酸化后，转运至胞内，再经过胞内的塔格糖-6-磷酸途径进一步代谢。上述技术中，lacF基因的功能即为负责磷酸化乳糖向胞内转运。而在植物乳杆菌中，乳糖代谢途径与乳酸乳球菌显著不同。首先由乳糖透过酶将乳糖直接转运至胞内，胞内的β-半乳糖苷酶再将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，这两个单糖分别进一步代谢，而且植物乳杆菌中β-半乳糖苷酶具有两种同工酶。因此与上述现有技术相比，本发明针对植物乳杆菌中乳糖独特代谢途径，开发了一种适合植物乳杆菌的食品级载体构建方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用，该套植物乳杆菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有的DNA原件来自于公认的安全的微生物，不含有抗生素筛选标记。

本发明的技术方案如下：

一株食品级宿主植物乳杆菌NZ1210的构建，包括如下步骤：

(1)提取植物乳杆菌WCFS1(Lactobacillus plantarum WCFS1)的基因组DNA；