[发明专利]一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用

权利要求书

1.一种食品级植物乳杆菌表达系统构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）一株食品级宿主植物乳杆菌NZ1210的构建方法，括如下步骤：

①提取植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1的基因组DNA；

②以步骤①的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对扩增基因lacA的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增基因lacA的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；

③使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤②中制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；

④将步骤③得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3018bp目的产物的菌体即为lacA基因敲除菌株；

⑤以步骤①获得的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的引物对扩增基因lacM的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对扩增基因lacM的下游同源臂，之后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得lacM基因敲除连接臂；

⑥使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤⑤中制得的lacM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；

⑦将步骤⑥得到的重组质粒转化入敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换的菌体，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的引物对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出3043bp目的产物即为同时敲除lacA和lacM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ1210，丧失乳糖利用的能力；

（2）将食品级表达载体pLP4180转化到步骤（1）中的食品级宿主植物乳杆菌NZ1210中，所述食品级表达载体pLP4180的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。