[发明专利]一种检测多巴胺的高灵敏荧光探针的制备方法及其应用

说明书

本发明属于生物传感器技术领域，特别是指一种检测多巴胺的高灵敏荧光探针的制备方法及其应用。将带有Asupgt;n/supgt;长度的适体加入TCEP的醋酸缓冲液中，然后与AuNPs溶液混合反应，孵育18h以上，再加入1×PBS调整溶液，孵育6‑8h，然后分两次加入NaCl溶液，静置后离心三次，每次离心混合物用PBS溶液清洗两次，然后将沉淀重新分散在PBS溶液中，加入FAM‑DNA，振荡反应，得高灵敏荧光探针；该方法通过金属增强荧光效应提高传感器的灵敏度，通过加入氧化石墨烯在减少离心过程的同时，实现传感器灵敏度的更高幅度增加。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，特别是指一种检测多巴胺的高灵敏荧光探针的制备方法及其应用。

背景技术

人类大脑包括数十亿个神经元和多种感官信息传递机制，通过神经元群体密切协调活动控制人或动物的思维和行为。当神经细胞产生功能障碍时，神经递质将会失调，神经异常放电，引起神经性疾病的发生。如多巴胺（dopamine，DA）是中枢神经系统中一种重要的神经递质，其在中枢神经系统、内分泌系统和心血管系统中发挥重要作用，很多疾病都与多巴胺的分泌不足或缺少有关，如：神经性食欲缺乏症、阿尔茨海默病和帕金森病等。在临床实践中，检测大脑中神经递质的微小变化对获取神经信息，预防和诊断神经性疾病有重要意义。

将核酸适体作为识别基团构建的荧光传感器称为荧光适体传感器，该传感器通过换能器将核酸适体与靶目标的强亲和力和特异性结合转换为荧光信号的变化，由荧光信号的变化量来对靶目标进行检测分析，兼具荧光分析和核酸适体的优点，可对多种生物小分子进行定量分析，且价格便宜、操作简单，应用前景广阔。金属增强荧光（Metal EnhancedFluorescence, MEF）现象的研究始于20世纪70年代，是指分布于金属表面、岛状粒子或溶胶粒子附近荧光团的荧光发射强度较之自由态荧光发射强度大大增加的现象。将金属增强荧光效应与荧光适体传感器结合即可得到荧光增强型适体传感器，为生物分子的高灵敏检测提供新方法。专利CN201910341109.4公开了一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法，通过多巴胺适配体识别多巴胺，使适配体从双链DNA1中脱离，从而不断引发酶切反应，荧光信号降低，利用此循环放大技术实现了对多巴胺的超灵敏检测。但对比文件1在检测过程中为了实现信号放大，加入微量的多巴胺就需要消耗较多的核酸外切酶、荧光染料、DNA等原料，检测成本较高，且检测过程复杂，而本发明通过金属增强荧光效应提高传感器的灵敏度，通过加入氧化石墨烯在减少离心过程的同时，实现传感器灵敏度的更高幅度增加，不需要消耗过多的原料。

发明内容

本发明提出一种检测多巴胺的高灵敏荧光探针的制备方法及其应用，结合了进金属增强荧光效应与氧化石墨烯对荧光基团的猝灭效应，加入被测物后，荧光信号由增强变为猝灭，相比于一般的荧光增强型传感器，该传感器荧光信号变化幅度更大，检测灵敏度更高。且加入被测物后，不需要进行离心处理，避免了离心过程中所能引入的各种误差，处理过程更为简单。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种检测多巴胺的高灵敏荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）将带有Aⁿ长度的适体加入TCEP的醋酸缓冲液中，然后与AuNPs溶液混合反应，孵育18h以上，得溶液Ⅰ；

（2）向经步骤（1）处理的溶液Ⅰ中加入1×PBS调整溶液的pH值和离子强度，再孵育6-8h，得溶液Ⅱ；

（3）向经步骤（2）处理的溶液Ⅱ中分两次加入NaCl溶液，每次间隔2-3h，然后再分三次加入NaCl溶液，每次间隔3-4h，静置40-50h，得溶液Ⅲ；

（4）将溶液Ⅲ离心三次，每次离心混合物用PBS溶液清洗两次，然后将沉淀重新分散在PBS溶液中，加入FAM-DNA，于37℃条件下振荡反应2-3h，得高灵敏荧光探针。