[发明专利]一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：核酸提取；高通量测序文库构建；将高通量测序文库构建中构建的测序文库进行定量；将定量后的测序文库，稀释至1‑4pM，在测序仪上进行高通量测序；对高通量测序中获得的测序数据进行分析。本发明的另一方面，还提供了一种病原微生物检测试剂盒，本发明所提供的基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法及试剂盒，使用片段化酶对DNA进行片段化，DNA的损失较机械法更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒。

背景技术：

感染性疾病是由病原微生物(细菌、病毒、真菌、寄生虫等)引起的疾病的统称。据统计，感染性疾病死因占全部死因的25％以上，是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。全球每年罹患感染性疾病的患者大约有4000万，我国患者约占四分之一，其中临床诊断病因不明占近百分之五十(约500万)。当不明原因的感染性疾病发生时,快速准确的鉴定病原体是精准治疗、有效监测、控制疾病蔓延和降低医疗负担的关键。

基于高通量测序的宏基因组技术不依赖传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够尽可能地获取样本中包含的所有核酸序列信息，然后与数据库进行比对分析，根据比对得到的序列信息来判断样本中所含微生物的种属信息，在病原体检测中发挥着重要的作用。高通量测序用于感染性疾病的诊断首次报道于2014年1例中枢神经系统感染患者。此外，在呼吸道感染中，高通量测序也用于包括痰液、肺泡灌洗液等多种呼吸道标本，并表现出良好的检测性能。血液样本也是高通量测序的重要应用领域，在血流感染的病原检测中也发挥着作用。

但是目前基于高通量测序技术进行病原微生物检测的技术一般采用传统的基于Illumina测序平台的文库构建方法，包括超声打断、DNA片段末端修复、接头连接和PCR扩增等多个步骤，实验操作复杂，且依赖特定的机械设备如Covaris打断仪，价格成本高且耗时长。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法、病原微生物检测方法及试剂盒，以解决现有技术中的至少一项技术问题。

具体的，本发明的第一方面，提供了一种基于宏基因组学的高通量测序文库构建方法，所述方法包括如下步骤：

S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；

S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；

S103，对S102中的产物进行纯化，获得高通量测序文库。

采用上述技术方案，使用片段化酶对DNA进行片段化，DNA的损失较机械法更小，同时片段化的速率也更快，提高了整个文库的构建效率。

优选地，步骤S101中，其反应体系包括：按体积份数计，

DNA样本X份，片段化缓冲液1-2份，片段化酶2-4份，Buffer EB将体系补足至15份，其中，所述DNA样本浓度为5-30ng/μl，

反应条件为：

优选地，所述反应体系还包括0.5-1份的增强剂(Enhance)。

优选地，所述反应体系中，按体积份数计，片段化缓冲液1.5份，片段化酶3份，Enhance0.75份，Buffer EB将体系补足至15份。