[发明专利]一种检测唾液链球菌的引物组和检测体系及其应用

说明书

本发明提供了一种检测唾液链球菌的引物组及其检测体系和应用；所述引物组合物为针对肠道细菌的16S rRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基，所述随机碱基的个数为3‑5个。基于引物组摸索验证检测体系，各步骤各条件相互配合，协同增持，使其检测结果稳定准确，检测步骤简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测唾液链球菌的引物组及其检测体系和应用。

背景技术

结直肠癌是世界第三大常见癌症，每年有120万患者被确诊为CRC，并造成每年60万人死亡，2015年中国结直肠癌发病率占全球24.3%，死亡数占全球22.9%，研究认为至少80%的大肠癌有大肠腺瘤演变而来，历时约10-15年，积极诊治大肠腺瘤是控制、减少大肠癌的重要途径，有报道指出，早期发现和治疗可使大肠癌的5年生存率高达90%。但是在我国实际上超过80%的患者确诊时已发展到中晚期，早期诊断率只有10%。因此，重视大肠癌的早期发现对于其预后的改善极其重要。

目前国内外常用的结直肠癌检测方法主要有结肠镜检、潜血试验（FOB）和粪便免疫化学检查（FIT）。目前最广泛最可靠的检查方法是结直肠镜检，然而，此检查属于侵入性操作，有一定的不适和并发症，患者体验差。FOB一般用于对无症状人群大肠癌和腺瘤的筛查，需要多次检测，且检出率较低。FIT利用单克隆或多克隆抗体直接检测人粪便样本中的血红蛋白，不受进食食物影响，但是FIT一次检测检出癌症的敏感性为80%，检测出高度不典型腺瘤的敏感性仅为20%-30%，为提高检出率，需要重复进行。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明通过对粪便或唾液样本中唾液链球菌（Streptococcus salivarius，Ss）的检测评估结直肠癌发病率的方法，本发明包含了唾液链球菌的特异性引物，通过添加随机碱基的方法，提高引物组合物与微生物组合的特异性和准确性。

本发明采用的技术方案如下：

第一方面，唾液链球菌引物组设计，本发明提供了一种鉴定粪便和唾液中唾液链球菌的引物组，所述引物组为针对细菌16S rRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基2-5个。通过调控随机碱基的数量，提高检测特异性。

微生物16S rRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，为保证引物特异性，选择在保守区内设计引物，另外相对于其他可变区，V3-V4区可覆盖98%以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物长度的要求。根据这个条件，可以设计一对鉴定粪便样本中所有微生物总量的引物。

优选地，所述引物组包括唾液链球菌引物和总菌引物。

优选地，所述引物长度为18-30bp，例如可以是18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp。

本发明中，发明人设计引物组并验证其特异性，比对出的序列均为细菌16S rRNA序列或全基因组序列。用引物通过PCR扩增出目的片段，然后进行电泳，产物条带与预期一致，且无任何杂带，对引物扩增出的片段进行一代测序，将测序所得序列在NCBI网站上Nμcleotide BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能进行序列比对，与预期产物序列相似度高于90%。

确定的唾液链球菌引物对为：SEQ ID NO.1-6，总菌引物为：SEQ ID NO.7-10.

确定条件：1）扩增产物单一且大小与预期一致；2）扩增产物测序结果与预期产物序列相似度高；3）融解曲线峰形为单峰且集中；4）扩增效率在90%-105%之间。

第二方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包含第一方面所述的引物组，以及DNA、qPCR SYBRGreen Mix和dd ddH₂O。