[发明专利]一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株及其构建方法和应用

说明书

一株猪种布鲁氏菌BI‑1基因缺失菌株及其构建方法和应用，该菌株是通过卡那霉素抗性基因替换猪种布鲁氏菌BI‑1基因得到的，其主要步骤为：以猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组为模板，PCR扩增得到BI‑1基因上、下游同源臂，与同样PCR扩增得到的卡那霉素抗性基因片段一起克隆入pUC18质粒，获得同源重组缺失质粒pUC18‑BI1‑KanR。将该质粒电转化猪种布鲁氏菌感受态细胞，经PCR鉴定，所得阳性转化子即为猪种布鲁氏菌BI‑1缺失菌株。与野生型菌株相比，该缺失菌株表现出生长速度减缓，菌落减小，细胞膜通透性增加，细胞聚合性增强等特点，提示该缺失菌株具有作为布鲁氏菌减毒活疫苗的潜质。

技术领域

本发明涉及一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人兽共患传染病，主要引起患病动物流产和不育，在人上主要表现为波状热、骨关节炎症、生殖系统炎症等，严重威胁人类的生命健康和畜牧业的健康、可持续发展。疫苗免疫接种是预防布鲁氏菌病最有效的手段，但是目前我国市售布鲁氏菌病疫苗在免疫保护力和区分野毒感染与疫苗接种方面尚存在诸多不足，而且全球范围内尚没有有效的人用布鲁氏菌病疫苗。因此，布鲁氏菌病疫苗的研制及相关研究亟待深入。

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌，球杆状，无荚膜，无鞭毛，不形成芽胞，以专业和非专业吞噬细胞为宿主细胞。布鲁氏菌进化出了多种毒力因子和毒力系统，一旦进入宿主细胞即通过各种毒力因子干扰、逃避宿主的免疫杀伤机制，建立胞内增殖，引起慢性感染。目前研究发现，外膜蛋白（Out membrane proteins, OMPs）、磷酸脂多糖(Lipopolysaccharide, L PS)、VirB IV型分泌系统、BvrR/BvrS双组份系统、核蛋白L7/L12、群体感应系统等是参与布鲁氏菌感染的重要毒力因子，大都具有较强的免疫保护活性，且大部分组分是膜相关分子。

Bax inhibitor-1 (BI-1)是在真核生物和原核生物中高度保守的跨膜蛋白，在真核生物中主要起着抑制BAX诱导的细胞凋亡功能，在原核生物中的功能尚不明确。但是，大肠埃希氏菌中的BI-1样蛋白YccA被证明是ATP依赖的金属蛋白酶FtsH的底物和调节因子，对细菌外膜的生物生成具有重要作用。我们的研究发现，BI-1缺失对布鲁氏菌的生长和外膜特性具有显著影响，表明BI-1缺失菌株具有制备减毒活疫苗及其相关检测方法的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪种布鲁氏菌Bax inhibitor-1 (BI-1)基因缺失菌株及其构建方法和应用，所要解决的技术问题是将猪种布鲁氏菌S2疫苗株进行BI-1基因缺失，进一步减弱其毒性，提高其在疫苗研制和相配套检测方法建立方面的可用性、有效性。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一株猪种布鲁氏菌Bax inhibitor-1 (BI-1)基因缺失菌株，其特殊之处在于：用卡那霉素抗性基因替换猪种布鲁氏菌BI-1基因获得。

一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

(1) 根据猪种布鲁氏菌基因组序列和pEGFP-C1基因序列以及pUC18质粒的酶切位点信息，设计所需PCR引物；

(2) 以布鲁氏菌S2疫苗株基因组为模板，PCR扩增获得BI-1上、下游同源臂BI1-UP和BI1-DW； 以pEGFP-C1质粒为模板，PCR扩增获得卡那霉素抗性基因KanR；

(3) 将步骤（2）得到的基因片段分别与pMD19T-simple载体连接，获得相应的重组质粒pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR；

(4) 将步骤（3）得到的重组质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行培养，提取相应重组质粒，送生物公司测序；