[发明专利]GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用

说明书

本发明公开了GmU3‑19g‑1和GmU6‑16g‑1的启动子序列，及其在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑载体系统中的应用，包括GmU3‑19g‑1和GmU6‑16g‑1的启动子的使用，及载体构建过程，并结合具体示例阐述该系统的使用。利用该系统可以同时编辑多个基因，为研究大豆中多基因家族以及基因直接的相互作用关系提供有力工具，同时可以大大缩短大豆中涉及多个性状(或者多个基因)的育种进程。

技术领域

本发明涉及GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

大豆[Glycine Max(L.)Merr.]起源于中国，是重要的油料和高蛋白作物，含有多种对人类有益的生理活性物质,如异黄酮等，此外大豆也是农业生产体系中重要的养地作物。基因打靶现象很早就被发现，但基因打靶技术在真核生物中的应用却较为缓慢，TALENs技术的出现加快真核生物基因打靶的研究，而CRISPR/Cas9技术的出现则掀起真核生物基因打靶研究的热潮，CRISPR/Cas9技术简便性和低成本等特点使得技术的普及性非常高。

CRISPR/Cas9系统的打靶效率依赖于sgRNA的高效表达，而sgRNA属于非编码RNA，需要有合适的启动子调控其表达，真核生物snRNA是一类非编码RNA，组成型表达，适合于调控sgRNA的表达。我们从大豆基因组中克隆了2个snRNA(GmU3-19g-1和GmU6-16g-1)的启动子序列，设计一套可用于多基因打靶的CRISPR/Cas9载体系统，可以在同一个植物表达载体组装4个，乃至更多的sgRNA。选择苯丙烷代谢途径中2个编码黄烷酮-3-羟化酶的GmF3H1和GmF3H2，以及1个编码黄酮合酶II的GmFNSII-1为靶标构建3个多基因敲除载体，通过大豆毛状根转化，发现该多基因编辑系统可以在大豆中发挥作用。这个系统可以为研究大豆中多基因家族以及基因直接的相互作用关系提供有力工具，同时可以大大缩短大豆中涉及多个性状的育种进程。

发明内容

本发明的目的是提供GmU3-19g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

本发明的另一目的是提供一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体组合。

本发明的又一目的是提供一种CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体的构建方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

GmU3-19g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

GmU3-19g-1启动子联合GmU6-16g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

GmU3-19g-1联合GmU6-16g-1启动子能够同时调控多个sgRNA的表达，实现靶向2～4个不同的靶标。

一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体pU3-sgR，含有GmU3-19g-1启动子，其中,U3pro-sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体组合，包含所述的载体pU3-sgR，以及含有GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体pU6-sgR；所述的pU6-sgR中GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明所述的载体组合在CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统中的应用。

一种CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体的构建方法,包含以下步骤: