[发明专利]GmU3-19g-1和GmU6-16g-1启动子在大豆多基因编辑系统中的应用

权利要求书

1.GmU3-19g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

2.GmU3-19g-1启动子联合GmU6-16g-1启动子在CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑系统中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是GmU3-19g-1联合GmU6-16g-1启动子能够同时调控多个sgRNA的表达，实现靶向2～4个不同的靶标。

4.一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体pU3-sgR，其特征在于含有GmU3-19g-1启动子，其中,U3pro-sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑的载体组合，其特征在于包含权利要求4所述的载体pU3-sgR，以及含有GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体pU6-sgR；所述的pU6-sgR中GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示。

6.权利要求5所述的载体组合在CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统中的应用。

7.一种CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体的构建方法,其特征在于包含以下步骤:

(1)将每个靶序列分别构建到sgRNA骨架载体中：根据基因打靶位点通过网站在线设计靶序列,合成引物，引物通过退火形成二聚体；将二聚体通过酶切位点BsmB I连接到含有GmU3-19g-1启动子或GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体上；含有GmU3-19g-1启动子的骨架载体命名为pU3-sgR，其中U3pro-sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；含有GmU6-16g-1启动子序列的骨架载体命名为pU6-sgR，其中GmU6pro-gRNA序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)将靶序列两两构建到pGmUbi-Cas9载体中；从pU3-sgR和pU6-sgR载体中PCR扩增出完整的表达框GmU6_pro/GmU3_pro+sgRNA骨架，引物为pU3-F/pU3-R和pU6-F/pU6-R；pGmUbi-Cas9载体使用Nco I和Xba I双酶切回收；通过T4连接酶将4个sgRNA骨架两两组合；连接到pSC-GmUbi3载体中，得到2个中间载体pGmUbi-Cas9-2×sgR；

(3)将四个靶序列构建到同一pGmUbi-Cas9载体中：通过引物F/R从第二个pSC-GmUbi3-2×sgR载体中PCR扩增出来GmU3_pro+sgRNA3骨架+GmU6_pro+sgRNA4骨架,第一个pGmUbi-Cas9-2×sgR载体用BstE II酶切回收，通过同源重组的方式将片段GmU3pro+sgRNA3骨架+GmU6pro+sgRNA4骨架连接到第一个pGmUbi-Cas9-2×sgR，得到最终的载体pGmUbi-Cas9-4×sgR。

8.按照权利要求7所述的方法构建的CRISPR/Cas9介导的多基因编辑载体。

9.一种CRISPR/Cas9介导的大豆多基因编辑方法，其特征在于包括将权利要求8所述的多基因编辑载体转入宿主大豆。