[发明专利]一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法

说明书

本发明公开了一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：步骤1、鸭TLR7基因PCR扩增及回收；步骤2、In Fusion进行载体和目的片段的重组；步骤3、菌落PCR检测。本发明在PCR上游引物起始密码子ATG前加入Kodak序列和BamHI酶切位点，这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组，这种克隆方法效率较高，并可通过测序有效地鉴定PCR产物，本发明具有：①快速：仅需要15分钟反应时间；②简单：不受片段酶切位点的影响，无需对片段酶切；③高效：阳性率达95％以上；④无缝：不引入额外的序列等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法。

背景技术

天然免疫系统是机体防御的第一道关卡，它们能识别病原微生物，触发细胞内与细胞间的信号通路，对抗病原体感染。模式识别受体(PRRs)是机体天然免疫系统的重要成分，主要有Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体(RLRs)、NOD样受体(NLRs)、AIM2样受体(ALRs)和C型凝集素样受体(CLRs)等，能够识别病原相关分子模式(PAMPs)，如微生物鞭毛、肽聚糖、脂多糖、CpG基序、单链和双链RNA等，释放有抗病原微生物作用的细胞因子(如IFN-β等)，从而诱导机体产生抗病原微生物天然免疫反应，在控制病原微生物感染和疫病发生过程中发挥重要作用。

TLRs是近年发现并备受关注的天然免疫系统中重要的一类PRRs，迄今已在人类和动物中发现至少16种，其中人10种，鼠12种，鸡10种，但这类受体在结构上均为典型的I型跨膜蛋白，每个成员都有类似的结构特征，包括胞外识别PAMPs的LRRs(富亮氨酸重复基序)、单一的跨膜区和胞内与接头分子(如MyD88、TIRAP等)相关的TIR(Toll/IL-1受体同源区)3个结构域，并具有识别病毒颗粒或DNA、dsRNA和ssRNA等核酸，诱导前炎症因子和I型干扰素(IFN-I)等细胞因子产生和树突状细胞(DC)成熟，启动获得性免疫反应的功能。目前在人类已经证明具有病毒识别功能的有TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9，但不同TLRs识别的PAMPs不同，如TLR3识别双链RNA病毒以及病毒复制过程中产生的双链RNA中间体，TLR7和TLR8识别富含G/U的单链RNA病毒，TLR9识别DNA病毒的非甲基化CpG DNA序列，它们在抗病毒天然免疫反应中具有重要作用。

TLR7是TLRs家族的重要成员之一。在哺乳动物中，TLR7激活可产生多种炎症因子[包括IFN-α、IFN-β、白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]，共刺激分子(CD40、CD80、CD86)、主要组织相容性复合体分子(MHC)IFN-α的上调。然而，目前对禽类TLR7的研究刚刚开始，有限的研究结果证明，鸡具有完整的TLR7基因，编码蛋白含有1047个氨基酸和1个富亮氨酸重复的保守模式，其氨基酸序列与人类TLR7同源性仅为62％，且鸡TLR7的配体识别模式与人和小鼠的TLR7有较大差别。生物信息学分析结果表明，鸡TLR7的基因结构有别于人和小鼠，其基因的外显子Ⅱ显著长于人和小鼠，且在转录过程中存在选择性剪切(ahernative splice)，产生3种不同的转录产物，导致LRR结构域发生明显变化，可能正是这种差异导致了PAPMs识别功能的变化。与鸡相似，鸭也具有完整的TLR7基因，但鸭TLR7与鸡TLR7的氨基酸序列同源性仅为85％，其差异主要发生在结合配体的LRR结构域。在斑胸草雀中，TLR7基因有两种(基因倍增导致)。但禽类TLR7基因功能研究迄今却鲜有报道。