[发明专利]一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒

说明书

本发明涉及病毒分析检测领域，具体涉及一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法，是在提取待测样品DNA进行病毒粒子DNA检测之前，加入DNase I与待测样品共孵育。本发明利用Dnase I对样品进行预处理，有效区分了游离ASFV核酸和ASFV粒子，避免了实际检测中出现假阳性的现象，提高了检测的准确性。另外，本发明改善了PCR和qPCR的引物，进一步提高了对ASFV粒子的检测限。最后，本发明得到的PCR和qPCR试剂盒，能够快速采样检测，特异性灵敏，价格低廉，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及病毒分析检测领域，具体涉及一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

技术背景

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是被世界动物卫生组织(Officeinternational des epizooties，OIE)列为实时通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASF是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病。ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)的唯一成员，也是虫媒病毒中唯一的DNA病毒，其基因组为双链DNA，大小为170kb～190kb之间，病毒粒子的外形近似六边形，直径约200nm。ASFV引起家猪和野猪特征性出血和发热，临床症状表现为发烧、皮肤发绀和多脏器广泛性出血，强毒株感染时死亡率高达100％。

自1921年在肯尼亚首次报道ASF后，该病主要在非洲地区流行(多次出现跨洲际流行，但均已基本扑灭)；然而，2007年格鲁吉亚暴发ASF，随后该病迅速蔓延至整个高加索地区和俄罗斯；随后，ASF传入东欧多国；2018年8月，ASF传入我国，并迅速蔓延至全国各地，给我国的生猪养殖产业产生了重创，导致了巨大的经济损失和社会影响。

当前，针对非洲猪瘟的实验室检测手段存在一定的局限性。主要有抗原检测以及核酸检测，抗原检测包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体试验、免疫层析试纸条等技术。但是抗原检测的灵敏性低于聚合酶链式反应(PCR)等手段，且结果易出现假阳性，准确性不高。

核酸检测包括PCR、实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)等，qPCR因其特异性高、敏感性好是目前应用最广泛的检测技术。经相关研究，无病毒活性的核酸阳性的样品饲喂仔猪，并不会引起其感染ASFV。但是，大家对ASFV核酸阳性产品避之不及，唯恐产品中含ASFV，核酸阳性结果势必造成一定的恐慌，尤其是饲料企业饱受打击，饲料产品的销售难以保障。

因此，活病毒的检测显得十分重要。

现阶段，活病毒检测通常包括病毒分离和红细胞吸附试验(Hemoadsorptiontest，HAD)。但是目前国内仅有少数机构实验室具有开展ASFV活病毒实验的资质，多数实验室无法进行，这使得活病毒检测实施困难。病毒分离和HAD测定需要消耗珍贵的仔猪原代骨髓细胞或肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophage，PAM)，但也只能检测到具有红细胞吸附特性的ASFV毒株，红细胞吸附试验一般需要7-15天，耗时较长。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中非洲猪瘟病毒检测过程中核酸阳性和病毒阳性区分困难的问题，提供了一种消除非洲猪瘟病毒粒子检测假阳性的方法。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测非洲猪瘟病毒活粒子的引物。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种消除非洲猪瘟病毒粒子检测假阳性的方法，是在提取待测样品DNA进行病毒粒子DNA检测之前，加入DNase I与待测样品共孵育。