[发明专利]包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法

权利要求书

1.一种纳米颗粒溶液，其特征在于：所述纳米颗粒溶液包含具有血液稳定性的聚合物胶束纳米颗粒，所述纳米颗粒含有质量比为20:1～5:1的聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物(PLGA-PEG-COOH)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇嵌段共聚物(DSPE-PEG-COOH)。

2.权利要求1所述的纳米颗粒溶液，其中所述纳米颗粒表面结合有功能分子，例如可与特定miRNA标志物互补配对的核苷酸序列、可靶向肿瘤细胞的靶向性分子、可与特异性抗原结合的抗体等。

3.权利要求2所述的纳米颗粒溶液，其中所述纳米颗粒的粒径大小为30～200nm，表面电荷为-20～-50mV。

4.权利要求2或3所述的纳米颗粒溶液，其中所述功能分子为可与特定miRNA标志物互补配对的核苷酸序列；且在所述核苷酸序列与特定miRNA标志物互补配对形成核苷酸双链后，阿霉素分子可嵌合至所述核苷酸双链，进而导致嵌合的阿霉素分子在荧光强度检测中发生荧光淬灭。

5.权利要求4所述的纳米颗粒溶液，其中所述核苷酸序列为可通过化学交联法与所述纳米颗粒表面羧基结合的5′端氨基化的DNA单链。

6.权利要求4所述的纳米颗粒溶液，其中所述miRNA标志物包括：癌症miRNA标志物，如miR-96-5p、miRNA-23b、miRNA-31、miRNA-21、miRNA-152、miRNA-451；类风湿性关节炎特征性miRNA，如miRNA-16、miRNA-155；肺结核特征性miRNA，如miRNA-150。

7.使用权利要求4-6中任一项所述的纳米颗粒溶液检测样品中特定miRNA标志物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取微量样品加至纳米颗粒溶液中，混合均匀并在常温静置10～60min，所述纳米颗粒溶液中的纳米颗粒表面结合有可与所述特定miRNA标志物互补配对的核苷酸序列；

(2)向(1)所得混合溶液加入10～100μM阿霉素分子，混合均匀；

(3)检测(2)所得混合溶液中的阿霉素荧光强度，与阴性对照组相比，若阿霉素分子的荧光强度明显减弱或消失则检测结果为阳性，若荧光强度不变则检测结果为阴性。

8.权利要求7所述的方法，其中所述miRNA标志物包括：癌症miRNA标志物，如miR-96-5p、miRNA-23b、miRNA-31、miRNA-21、miRNA-152、miRNA-451；类风湿性关节炎特征性miRNA，如miRNA-16、miRNA-155；肺结核特征性miRNA，如miRNA-150。

9.权利要求4-6中任一项所述的纳米颗粒溶液在制备疾病检测试剂中的用途，所述疾病包括癌症、类风湿性关节炎、肺结核等。

10.一种用于制备纳米颗粒溶液的方法，其包括以下步骤：

(1)在第一溶液中使聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物(PLGA-PEG-COOH)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇嵌段共聚物(DSPE-PEG-COOH)以20:1～5:1的质量比混合；

(2)将步骤(1)的混合物逐滴加入4％乙醇水溶液中，同时以60～150W的功率进行超声混合，促使PLGA-PEG-COOH和DSPE-PEG-COOH进行自组装，获得聚合物胶束溶液；

(3)向所述聚合物胶束溶液中相继加入1-(3-二1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，通过化学交联法将可与特定miRNA标志物互补配对形成核苷酸双链的5′端氨基化的DNA单链结合到胶束表面上，其中加入的EDC和NHS与溶液中聚合物的摩尔比分别在5:1～30:1范围内；

(4)使用截留分子量为10～100kD的透析袋，以透析法除去游离分子杂质，得到纯化的纳米颗粒溶液。

11.权利要求10所述的方法，其中所述第一溶液为氯仿、乙腈或二甲基亚砜。