[发明专利]一种Diels-Alder反应酶及其应用

说明书

本发明提供一种Diels‑Alder反应酶及其应用，属于基因工程技术领域。所述的Diels‑Alder反应酶为MaDA酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码其的基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了MaDA酶的同源蛋白MaDA‑1和MaDA‑2，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.10、12所示。本发明发现来源于桑树的MaDA酶及其同源蛋白能够以查尔酮和含有脱氢异戊烯基化合物为底物，立体专一性合成endo构型天然产物，体外制备D‑A类型天然产物及其类似物，有助于开发和利用这类天然产物的药用价值，为其他含有六元环的重要化工前体或天然产物的合成提供了可能性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种来源于桑树的Diels-Alder反应酶及其在促进Diels-Alder(D-A)反应中的应用。

背景技术

Diels-Alder(D-A)反应是共轭二烯(diene)与亲二烯体(dienophile)间发生的[4+2]环化反应，是有机化学中构建碳-碳键的重要方法之一，它能一步构建新的六元环和多个手性中心，迅速提高分子的复杂程度，在合成化学中扮演者重要的角色。自然界中存在大量含有六元环骨架的天然产物，这类分子往往结构复杂，但却具有良好的生物学活性，例如抗癌明星分子紫杉醇(taxol)以及dynemycin A。这类天然产物的全合成往往依赖D-A反应作为关键步骤来构建六元环骨架以及新的手性中心，但由于D-A反应缺乏良好催化剂来控制该反应的区域、endo/exo以及立体选择性，在合成过程中会出现很多副产物从而降低目标产物的产率以及立体选择性，如图1所示，这大大降低了D-A反应在全合成以及药物合成中的应用价值。因此开发和利用能够催化D-A反应进行的酶，使之能够选择性地产生某种特定立体结构(例如图1中圆框所示)的D-A产物不仅具有科学创新的价值，也具有很强的工业应用价值，但遗憾的是，目前从自然界中还未发现能够选择性催化分子间D-A反应的酶。

桑白皮(桑树的根皮或者茎皮)是传统中药，具有抗炎，利尿、平喘等等用途，同时也是治疗艾滋病的复方药物(司艾特散)中的有效成分。桑白皮中富含D-A类型的黄酮类天然产物，这些天然产物结构独特，具有良好的抗菌、抗病毒以及抗糖尿病等的生物活性，推测其是由桑树中的氧化酶以及D-A反应酶(DAase)共同参与而生成的，如图2所示。由于其结构复杂，含有多个手性中心，实现这类天然产物的不对称全合成面临着很大的挑战。虽然有少数几例利用手性硼酸复合物促进的不对称D-A反应来实现该类天然产物不对称全合成的报导，但合成化学仍然面临合成路线长，选择性差以及产率低的难题。相比于化学催化剂，酶具有高效性以及立体选择性，因此，发现桑树中分子间D-A反应酶不仅能够绿色高效实现桑树中endo-类型D-A天然产物及其类似物的合成，为开发和利用这类天然产物的药用价值奠定了基础，同时也为其他含有六元环的重要化工前体或天然产物的合成提供了新的可能性。

发明内容

本发明的目的是提供一种D-A反应酶及其在促进D-A反应中的应用。

第一方面，本发明提供了一种Diels-Alder反应酶，其来源于桑树，命名为MaDA酶，具有：1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的序列与SEQ ID No.1同源性为80％、85％、90％、95％、98％、99％，且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

进一步地，本发明还提供了MaDA酶的同源蛋白，其分别为MaDA-1、MaDA-2，分别具有：如SEQ ID No.10、12所示的氨基酸序列；其核苷酸序列分别如SEQ ID No.9、11所示。

本发明进一步提供编码所述Diels-Alder反应酶的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或