[发明专利]一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体N35D、A179E，pH 7.0条件下催化酶活性分别提高238％、244％。pH 4.5条件下处理12h酶活分别剩余83.9％、85.5％，相比对照野生型酶残余酶活24.8％，突变体酸稳定性有明显提高。因此，本发明提供的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体N35D、A179E具有较好的酶学性质。

技术领域

本发明涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的原料；在食品领域，L-丙氨酸具有甜味，能与谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品风味，而不破坏食品原有的风味；在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6和L-氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前体)的主要原料；同时，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的主要成分，也是心肌功能增强剂。

在化学合成生产中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常见思路，但该方法存在产品质量差、合成路线长、收率低、成本高、环境污染严重等缺点，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和发酵法制备L-丙氨酸已成为工业生产上主要采用的方法。

目前用于制备L-丙氨酸的生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，敲除次级代谢产物编码基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，获得生产L-丙氨酸菌株，在培养微生物过程中合成L-丙氨酸；周丽等以野生型大肠杆菌为出发菌株，敲除代谢产物合成途径编码基因以及丙氨酸消旋酶编码基因，将L-丙氨酸脱氢酶基因转入缺陷型菌株中获得目的菌株，该菌株发酵生产L-丙氨酸在摇瓶水平产量可达67.2g/L(引用文献：周丽，邓璨，崔文暻，刘中美，周哲敏.温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L丙氨酸[J].微生物学通报,2015,42(11):10.)。另一种方法是生物酶法，即通过表达L-天冬氨酸β-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去β-羧基生成L-丙氨酸。编码L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。目前发现的L-天冬氨酸β-脱羧酶大多具有较差的酸稳定性，在中性条件(pH 7.0)下催化活性较低。徐虹等人通过诱变获得一株具有L-天冬氨酸β-脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L-天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长(引用文献：徐虹,王雪根,刘济瑞,等.利用假单胞菌天冬氨酸_脱羧酶高效生产L_丙氨酸[J].南京化工学院学报,1995,17(1).)；Wang等人在大肠杆菌异源表达Pseudomonas sp.ATCC 19121来源的Asd酶，该酶比酶活为280U/mg，比酶活较低(引用文献：Wang N-C,Lee C-Y.Molecular cloning of the aspartate 4-decarboxylase gene from Pseudomonas sp.ATCC 19121 and characterization of thebifunctional recombinant enzyme[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,73(2):339-348.)。

因此，提供一种高产L-丙氨酸的方法、一种酶活更高、酸稳定性更高的L-天冬氨酸β-脱羧酶，对于工业应用生产L-丙氨酸具有重要的意义。

发明内容

为了解决这些问题，本发明通过对编码抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因进行突变，构建得到两个酸稳定性提高的突变体N35D、A179E。

本发明的第一个目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，所述L-天冬氨酸β-脱羧酶含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。