[发明专利]一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法、重组乳酸菌及其用途

权利要求书

1.一种胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法是在乳酸菌中过表达编码酰基载体蛋白的基因acpP；

所述编码酰基载体蛋白的基因acpP的核苷酸序列为SEQ ID No.1；

所述乳酸菌为乳酸片球菌或乳酸乳球菌；

所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法，具体步骤如下：

以P.acidilactici CGMCC No.17856的基因组为模板，分别以SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID No.1的acpP基因，然后将如以上核苷酸序列所示的基因片段与表达载体pNZ8148或pMG36e载体通过限制性内切酶进行酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到了含有编码酰基载体蛋白的基因acpP的重组质粒；

再将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactis NZ9000中，得到耐受性提高的重组乳酸菌，即为胁迫耐受性增强的乳酸菌；

所述将重组质粒导入宿主乳酸菌P.acidilactici CGMCC No.17856或L.lactisNZ9000的具体步骤如下：

乳酸菌活化后进行扩大培养，当生长OD₆₀₀值在0.4～1.2时收集经扩大培养所得的菌体，用电击缓冲液A洗涤菌体3次后，使用终浓度为1000～3000U/mL的溶菌酶处理菌体，最后再用电击缓冲液B使菌体重悬，得感受态细胞；

向制备得到的感受态细胞中加入验证正确的重组质粒，吹吸混匀，然后转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液，电击参数为2.0kV/cm，5ms，电击结束后，迅速将细胞悬液转移到装有复苏培养基的EP管中，37℃静置培养2h，取菌液涂布在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体平板上，37℃培养36～72h；氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR和酶切验证，最终获得正确的P.a-acpP重组乳酸片球菌菌株，即为重组乳酸菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述电击缓冲液A的配方为：质量浓度10％甘油，蔗糖150～200g/L，K₂HPO₄20～40g/L，KH₂PO₄1～3g/L和MgCl₂0.1～0.3g/L，溶剂为水；

电击缓冲液B的配方为：质量浓度10％甘油，0.4～0.6mol/L蔗糖，溶剂为水；

3.如权利要求书1或2所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在提高乳酸菌胁迫抗性方面中的应用。

4.如权利要求书1或2所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。

5.利用如权利要求1或2所述的胁迫耐受性增强的乳酸菌的构建方法制备得到的胁迫抗性提高的乳酸菌。

6.如权利要求5所述的胁迫抗性提高的乳酸菌在食品、药品、饲料、化学品领域方面中的应用。