[发明专利]检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒，属于水产病原生物检测试剂技术领域。本发明检测对虾肝肠胞虫的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。用本发明引物组检测对虾肝肠胞虫，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

技术领域

本发明属于水产病原生物检测试剂技术领域，具体涉及一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒。

背景技术

近年来，随着养虾业的再次兴旺，对虾养殖规模不断扩大，但由于对虾病害严重，给对虾养殖业造成了较大的经济损失。对虾肝肠胞虫病(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是对虾养殖中危害严重的病害之一。目前，EHP已在中国多个对虾养殖区被检出，且检出率有增加的趋势。

肝肠胞虫属于微孢子虫科、肠胞虫属，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。成熟的孢子呈椭圆形，长度0.75-1μm，后端有一个空泡，胞内含一个细胞核，5-6个极丝圈，1个与极丝相连的锚盘，和1层电子致密的孢子壁。我国最早于2013年在养殖的凡纳滨对虾中检出了EHP的感染，并且检测样品中具有很高的阳性检出率；对虾虾肝肠胞虫寄生发病率约为25％，导致养殖产量减少15-20％，在全年较少发生白斑综合症的情况下，EHP的感染产生的经济损失达3亿元。EHP感染可导致虾免疫力降低，继而由水体中的条件致病菌引起继发感染，出现肠炎、组织坏死、红体等多种病症。EHP可以直接通过养殖水体在对虾中直接水平传播，即通过虾传播，虾经口摄食寄生EHP的死虾/病虾、鲜活饵料或环境中的孢子体而感染。孢子可在养殖环境中累积，从而导致疫情的传播。

隐孢子虫在世界上的分布非常广，是一种体积微小的球虫类寄生虫，众多脊椎动物都有隐孢子虫。但目前EHP感染还没有有效的防治药物，而EHP比一般的微孢子虫小，且不形成肉眼可见的胞囊，且感染EHP的对虾不表现出明显的疾病症状，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大批死亡。因此，需要在实验室采用组织学或分子生物学方法确诊。也就是说苗种产地检疫工作中进行该病原的定性或定量检测，对于该病的预防具有重要意义。

通常采用PCR方法检测对虾肝肠胞虫，虽然灵敏度高，但对仪器的要求严格，易出现假阳性。随着分子生物学的发展，新型PCR检测方法不断涌现，例如，专利文件201510287845.8提供了一种套式引物用于养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警，其主要是基于两对引物进行PCR扩增，虽然该套式引物检测灵敏度很高且特异性好，但是，其检测过程仍需依赖PCR仪，检测过程也需要专门仪器。专利文件201610429433.8公开了一种引物组配合使用的探针采用TaqMan实时荧光定量PCR检测虾肝肠胞虫，其检测方法虽比普通PCR的灵敏度高，而且免去了电泳等复杂的操作，但是其检测设备仍需依赖荧光定量PCR仪。专利201710538284.3提供一种南美白对虾肝肠胞虫LAMP检测的方法，降低了肝肠胞虫检测对大型昂贵仪器的依赖，简化了常规PCR检测繁琐的操作流程；但是，其染料选择羟基萘酚蓝，可通过肉眼辨别接测结果为紫罗兰色或天兰色来判别检测结果的阴性或阳性；然而相对于目标物拷贝数少的样品则难以区分颜色差别；而且现有LAMP等温扩增技术由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用比较局限。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒，用本发明引物组检测对虾肝肠胞虫，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

检测对虾肝肠胞虫的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。