[发明专利]识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法

说明书

本发明属于基因工程领域，涉及识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及植物基因组编辑方法。本发明要解决的技术问题是建立能够高效识别TTTV和TTV双PAM位点的新的CRISPR‑Cas12a植物基因组定向编辑技术。本发明解决上述技术问题的技术手段是提供了一种新的具有核酸酶Cas12a蛋白以及该蛋白的编码基因。还提供了基因组定向编辑载体和编辑方法。本发明新Cas12a蛋白具有识别TTTV、TTV双PAM位点的能力。在TTTV PAM位点和TTV PAM位点都有高效的编辑效率。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组CRISPR-Cas12a定向编辑载体及植物基因组编辑方法。

背景技术

基因组定向编辑技术是生物学研究的前沿与热点领域，通过对基因组特定区域进行缺失、置换、敲入或核苷酸修正等方式来实现基因组精确定向编辑。基因组编辑技术主要有：锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)，它实现了基因的靶向操作，并得到了广泛的应用。但锌指核酸酶组装针对特定DNA序列的ZFNs，所需的工作量大，花费也十分昂贵，而且特异性和效率不高；类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN)，相比锌指核酸酶，它设计更简单、特异性更高、效果更为明显。其缺点是模块组装过程繁琐，成本很高；2013年初发展起来的CRISPR-Cas9(Clusteredregularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated 9)技术(SanderJoung)。CRISPR-Cas9系统因其设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势而被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制及遗传改良中。尽管CRISPR-Cas9被认为是遗传研究领域的革命性技术，但研究者依然没有放弃CRISPR技术的改进及拓展工作。野生型SpCas9核酸酶介导的序列特异DNA剪切需要识别5’-NGG-3’PAM位点，使得SpCas9核酸酶在目标基因组中的有效编辑区间受到明显限制。同时，SpCas9基因组编辑系统存在潜在的非特异剪切活性即“脱靶”，会对编辑对象产生不确定的生物学效应。为此，研究人员从其它不同细菌中获得Cas9核酸酶用于基因编辑工具，如SaCas9、StCas9、NmCas9(Cebrian-SerranoDavies,2017)。同时，研究者开发出识别不同PAM序列的Cas9变异体xCas9-NG、SpCas9-NG、VQR-Cas9(NGA PAM)、EQR-Cas9(NGAG PAM)、VRER-Cas9(NGCG PAM)、SaKKH-Cas9(NNNRRT PAM)。随后研究者开发出了能在植物中应用的Cas9变异体。