[发明专利]识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法有效
| 申请号： | 201911106924.9 | 申请日： | 2019-11-13 |
| 公开（公告）号： | CN110747187B | 公开（公告）日： | 2022-10-21 |
| 发明（设计）人： | 周建平;张勇;郑雪莲;刘诗诗;何瑶;唐旭 | 申请（专利权）人： | 电子科技大学 |
| 主分类号： | C12N9/22 | 分类号： | C12N9/22;C12N15/55;C12N15/84 |
| 代理公司： | 成都泰合道知识产权代理有限公司 51231 | 代理人： | 孙恩源 |
| 地址： | 611731 四川省成*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 识别 tttv ttv pam cas12a 蛋白 植物 基因组 定向 编辑 载体 方法 | ||
1.Cas12a蛋白，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID No. 1所示。
2.权利要求1所述的Cas12a蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的Cas12a蛋白的编码基因，其特征在于核苷酸序列如Seq IDNo. 2所示。
4.含有权利要求2或3任一项所述的编码基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体含有Cas12a蛋白表达单元，结构为ZmUbi1-NLS-MorCas12a-NLS-AtHSP。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述的Cas12a蛋白表达单元核苷酸序列如Seq ID No. 3所示。
7.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：还含有crRNA克隆及转录单元，可共表达Cas12a蛋白和crRNA。
8.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述的crRNA克隆及转录单元的结构为OsUbi1-HH Ribozyme-crRNA scaffold-ccdB-HDV Ribozyme-pinII。
9.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述的crRNA克隆及转录单元的核苷酸序列为Seq ID No.4或者为Seq ID No.5所述。
10.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：还含有潮霉素抗性筛选基因。
11.权利要求4～10任一项所述的表达载体在构建CRISPR-Cas12a基因编辑系统中的用途。
12.CRISPR-Cas12a基因编辑的方法，其特征在于：使用了权利要求4～10任一项所述的表达载体为CRISPR-Cas12a基因编辑系统提供Cas12a蛋白活性。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、骨架载体构建：构建权利要求4～12任一项所述的表达载体作为CRISPR-Cas12a骨架载体；
b、定向基因编辑载体构建：针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及crRNA，人工合成crRNA的引物对，将引物对退火形成带粘性末端的双链DNA，将双链DNA替换CRISPR-Cas12骨架载体中的ccdB元件，获得定向编辑表达载体；
c、定向基因编辑及检测：使用步骤b得到定向编辑表达载体转化原生质体，检测原生质体的基因定向编辑情况，将成功定向编辑的原生质体培养得到定向基因编辑植株；
或者；
使用步骤b得到定向编辑表达载体转入根癌农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入目标植物，获得定向基因编辑植株。
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