[发明专利]一种百部内生链霉菌中吡咯-2-羧酸酯类化合物的制备方法及其应用

说明书

本发明阐述一株百部内生链霉菌中吡咯‑2‑羧酸酯类化合物的制备方法与应用，所述的吡咯‑2‑羧酸酯类化合物具有化合物1‑10所示的结构。本发明首次从百部内生链霉菌中分离得到吡咯‑2‑羧酸酯类化合物，且所有化合物均从自然界首次分离得到。将上述化合物2,3,4,5,9,10,11(对叶百部碱),12(吡咯‑2‑羧酸),BS‑1(链霉菌粗提物)，IM(吡虫啉)，BI(联苯肼酯)应用到蚜虫和二斑叶螨的防治中，数据表明该类化合物对棉蚜虫有高抑制活性(LC50范围：3.55‑32.00ppm)；对二斑叶螨有中等抑制活性(LC50范围：197.6‑685.5ppm)。

技术领域

本发明属于中药内生菌技术领域，具体涉及百部内生菌中吡咯-2-羧酸酯类新化合物的分离纯化及其在防治棉蚜虫和二斑叶螨的医药新应用。

背景技术

自从上世纪末文献报道发现植物内生真菌可以产紫杉醇后，国内外学者纷纷把目光转向植物(特别是药用植物)内生菌的研究，发现了植物内生菌除能够适应植物内部特殊环境外，还能够编码产生多种生物活性物质，用来增强植物对外界的抵抗力。此外，内生菌因长时间与宿主协同进化使其产生某些与宿主植物相同或结构相似的具有药用价值的代谢产物。近年来从植物内生菌发酵产物中分离得到的代谢产物结构类型多样，包括生物碱、甾体、萜类、蒽醌类、环肽类、黄酮类等。

中药百部是传统的止咳和杀虫药物，中国药典收载的百部有3种：直立百部、蔓生百部和对叶百部；活性成分百部生物碱以含饱和氮杂奥化吡咯环状母核结构为特征，具有镇咳、祛痰、杀虫、抗菌等药理作用。广西为百部的主要道地产区之一，但是由于近些年的破坏性采收和生态环境的破坏，百部资源正在锐减。

百部内生菌产生与宿主植物活性相似的化合物，其内生菌次生代谢产物可作为新型药物或农药的潜在来源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：

提供一种百部中内生链霉菌中吡咯-2-羧酸酯化合物的制备方法，有望解决用于杀虫作用的百部药材的替代品，以及提供百部内生菌中吡咯-2-羧酸酯类新化合物具有在防治蚜虫和二斑叶螨的医药新应用。

发明采用如下技术方案：

吡咯-2-羧酸酯类新化合物的结构式如下：

式I中：

R1和R2可以相同或不同；

R1选自氢、甲基、乙基、氨基、甲酰胺基、乙酰胺基中的一种；

R2选自氢、羟基、羟甲基、羟乙基、氨基、甲酰胺基、乙酰胺基中的一种；

n选自1到5。

吡咯-2-羧酸酯类化合物为中药百部中内生链霉菌分离得到的化合物，其中所有化合物均为新化合物。

所述的百部内生链霉菌BS-1是经过下述提取分离方法获得：采集百部新鲜药材，进行表面消毒处理。分别取百部的根茎叶切碎后放入离心管，加少量灭菌水，涡旋，80℃热水浴1min，取200uL涂板于ISP4和燕麦培养基(加双抗：两性霉素50mg/L；萘啶酸25mg/L)，28℃培养一到两个月，并用M2平板纯化。

所述的百部内生链霉菌发酵液粗提物通过下述方法得到：配制种子培养基，将BS-1菌株接入种子培养基，26～30℃，培养3～5天得种子培养液；将得到的种子培养液接入发酵培养基中，26～30℃，200rpm培养6～9天得发酵物。加入2～6％XAD-16树脂，继续振荡4～6小时，离心弃去上清液，加入甲醇提取，涡旋超声，离心，取上清甲醇溶液，蒸干得到菌株粗提物。

所述的百部链霉菌中的吡咯-2-羧酸酯类化合物是通过下述方法分离纯化：将所述BS-1粗提物，先后采用MCI、反相硅胶、Sephadex LH-20分离材料进行柱色谱分离，并辅以prep-HPLC方法进行纯化，获得单体化合物。