[发明专利]在植物中高效生成不携带转基因元件的突变体的CRISPR/Cas9系统和方法

说明书

本发明涉及一种用于在植物中进行CRISPR/Cas9基因编辑的构建体，以供高效产生不携带转基因元件的、经过基因编辑的突变体植物。还涉及使用所述构建体对植物进行CRISPR/Cas9基因编辑的系统和方法。

技术领域

本发明属于植物基因编辑领域。具体来说，本发明涉及一种用于在植物中进行CRISPR/Cas9基因编辑的基于自切割肽的构建体，以及利用该构建体高效获得经过编辑且不携带转基因元件的突变体的系统和方法。本发明还进一步提供用于在植物中进行CRISPR/Cas9多重基因编辑的构建体，以及利用该构建体高效获得经过多重编辑且不携带转基因元件的突变体的系统和方法。

背景技术

源自II型原核生物适应性免疫系统的规律成簇间隔短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats；CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)基因组编辑系统是一种精确的基因编辑体系，近年来已经被广泛用于动植物等功能基因组的研究。常规的CRISPR/Cas9系统含有两个组分，即用于识别和匹配靶DNA的单导向RNA(single-guide RNA，sgRNA)和用于切割靶DNA的Cas9核酸内切酶。

在使用CRISPR/Cas9技术对植物进行基因编辑之后，保留在植物基因组中的CRISPR/Cas9表达元件会使经过编辑的植物落入转基因植物的范畴。实践中通常希望经过编辑的生物体最终不携带任何用于基因编辑的外源元件，换言之希望获得非转基因生物体。无论在农业上还是商业上，非转基因植物都更受青睐，更容易通过审批，更广泛得到应用，实现更高的价值。然而与动物不同，获得不含CRISPR/Cas9表达元件的植物更为困难。在动物中，可以通过同时向受精卵中注射多个sgRNA和Cas9的转录本实现快速高效地获得多个位点编辑的非转基因动物。在植物中编辑通常是针对植物组织如愈伤组织或生殖细胞等进行的，例如通过农杆菌侵染的方法将CRISPR/Cas9表达元件先导入植物中。因此，想要获得经过基因编辑但又不含CRISPR/Cas9表达元件的植株需要待CRISPR/Cas9将目的基因编辑后，再利用孟德尔分离定律将CRISPR/Cas9元件分离并采用基因型鉴定来进行，这样的方法耗时耗力。

除了对于获得非转基因植物的期望，去除经编辑植物中的CRISPR/Cas9元件在技术上也有其必要性。如果不去掉CRISPR/Cas9元件，任其残留在植物体内，一方面难以区分变异的来源，不易获得稳定的、可遗传的突变；另一方面增加了脱靶的风险。具体而言，在通过CRISPR/Cas9系统生成的突变体植物中仍然存在Cas9和sgRNA的情况下，将难以区分某个突变是遗传自上一代还是在当前世代中新产生的，而明确这一点又非常重要，因为在当前世代中新产生的突变可能是无法遗传的体细胞突变。另外，CRISPR系统中使用的编辑元件包括Cas9和sgRNA以组成型表达的方式存在，若存在于T2代或者甚至是后续世代中，可能借由sgRNA错配对已经突变的靶序列进行再次编辑或对基因组其它的相似序列进行编辑生成脱靶突变。此外，若CRISPR/Cas9元件残留在植物体内，将无法进行基因功能的互补验证，因为新转入的基因序列会被CRISPR/Cas9元件编辑。同时，含有CRISPR/Cas9元件残留在植物通常被认为是转基因植物，很难被批准在商业上生长应用。

因此，开发一种能够简便地筛选不携带CRISPR/Cas9转基因元件的编辑植物特定基因的方法对于植物功能基因研究和农业生产都至关重要。