[发明专利]在植物中高效生成不携带转基因元件的突变体的CRISPR/Cas9系统和方法

权利要求书

1.一种用于植物的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建体，其包含Cas9表达盒，所述Cas9表达盒从5’到3’包含：

(a)用于Cas9表达盒的拟南芥泛素10基因(AtUBQ10)启动子，

(b)核酸酶编码序列，

(c)自切割肽编码序列，和

(d)报告基因序列，

其中(a)和(b)-(d)可操作地连接使得所述核酸酶编码序列和报告基因序列在所述启动子的调控下，所述核酸酶编码序列编码Cas9或其具有DNA切割活性的片段或变体，并且所述自切割肽编码序列编码源自猪捷申病毒的2A肽并且为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或其编码相同多肽的突变体。

2.权利要求1所述的构建体，其中所述报告基因编码选自下组的蛋白质：萤光素酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。

3.权利要求1所述的构建体，其中所述启动子为在植物中组成型表达的启动子。

4.权利要求1所述的构建体，其中所述构建体在核酸酶编码序列的两个侧翼均包含核定位信号(NLS)编码序列。

5.权利要求1-4中任一项的构建体，其进一步包含sgRNA模块，所述sgRNA模块包含一个或多个sgRNA表达盒，其中每个sgRNA表达盒从5’到3’包含：

(e)用于sgRNA表达盒的启动子；和

(f)针对待编辑的靶DNA序列的sgRNA。

6.一种制备用于在植物中进行CRISPR/Cas9基因编辑的构建体的方法，包括向载体中引入Cas9表达盒，所述Cas9表达盒从5’到3’包含：

(a)用于Cas9表达盒的拟南芥泛素10基因(AtUBQ10)启动子，

(b)核酸酶编码序列，

(c)自切割肽编码序列，和

(d)报告基因序列，

其中(a)和(b)-(d)可操作地连接使得所述核酸酶编码序列和报告基因序列在所述启动子的调控下，所述核酸酶编码序列编码Cas9或其具有DNA切割活性的片段或变体，并且所述自切割肽编码序列编码源自猪捷申病毒的2A肽并且为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或其编码相同多肽的突变体。

7.权利要求6的方法，进一步包括向载体中引入包含一个或多个sgRNA表达盒的sgRNA模块，其中每个sgRNA表达盒从5’到3’包含：

(e)用于sgRNA表达盒的启动子；和

(f)针对带标记的靶DNA序列的sgRNA。

8.权利要求7的方法，其中所述包含多个sgRNA表达盒的sgRNA模块通过将多个sgRNA表达盒组装在一起获得，所述组装包括在每个sgRNA表达盒的上游和下游分别添加上游限制酶和下游限制酶，所述上游限制酶和下游限制酶为不同的限制酶且互为同尾酶，其中为所有sgRNA表达盒添加的上游限制酶均相同，且为所有sgRNA表达盒添加的下游限制酶均相同。

9.通过权利要求6-8中任一项的方法获得的构建体。

10.一种在植物中进行基因编辑的方法，包括使用权利要求1-5或9中任一项的构建体。

11.一种在植物中获得不携带转基因元件的突变体的方法，包括：

(i)使用权利要求5或9的构建体转化植物；

(ii)选择报告基因表达阳性的第一代植物，作为转化体；

(iii)传代(ii)中的第一代植物获得第二代植物；和

(iv)选择报告基因表达阴性的第二代植物，作为经过基因编辑且不携带转基因元件的突变体。

12.权利要求11的方法，在步骤(ii)和(iv)中通过报告基因表达选择出植物之后，鉴定选出植物的靶基因序列以确认其经过编辑。