[发明专利]多重PCR检测人鱼共患病病原菌的方法

说明书

本发明涉及一种PCR检测人鱼共患病病原菌的方法，包括：提取溶藻弧菌、类志贺毗邻单胞菌、副溶血弧菌、无乳链球菌、霍乱弧菌、创伤弧菌的基因组DNA；对病原菌的基因组DNA进行引物设计；利用设计的引物和PCR方法同时对溶藻弧菌、类志贺毗邻单胞菌、副溶血弧菌、无乳链球菌、霍乱弧菌、创伤弧菌的基因组DNA进行扩增和检测。本发明的方法能够同时检测多种病原菌，且特异性和灵敏度高。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，更具体地，涉及多重PCR检测人鱼共患病病原菌的方法。

背景技术

人鱼共患病指水生动物和人类之间自然传染的疾病。传染源包括鱼、虾、蟹等。这类疾病已成为当今世界上最关注的公共卫生问题之一。根据国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)，畜禽水产健康养殖与疫病防控是产业科学发展的重要主题。随着人民生活水平的不断提高，我国水产品的市场供应日趋完善，消费量不断上升。尤其是我国各地居民普遍有进食生鲜食品的习惯，例如生鱼片、生蚝、生虾等。人鱼共患病病原主要的传播方式有两种：穿刺、擦伤或者皮肤溃疡引起的伤口接触性感染或进食生鲜导致的食源性感染，弧菌感染鱼后可能导致厌食、溃疡等症状，人通过摄食或者创伤接触感染的水产品，可能会感染创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌等而引发疾病，如若发病早期未得到及时正确的诊断死亡率极高。链球菌也是人鱼共患疾病的主要病原菌，临床症状表现为腹胀、心内膜炎和脑膜炎等。伤口接触水产品引起的链球菌感染致病的案例在加拿大、美国和新加坡等地都有相关的报道，其中85％的接触性感染发生在亚洲。其它人鱼共患病原菌还包括诺类志贺毗邻单胞菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌等，均对食品安全及国民健康构成了严重威胁。

病原菌的检测经历了从传统培养法、免疫学检测方法和分子生物学检测的发展历程。但是目前的检测方法尚不能完全令人满意，仍存在改进空间。

发明内容

为弥补现有技术的不足，解决现有技术中病原菌检测周期长、一次性检测种类少的问题，本发明提供了一种同时检测六种人鱼共患病病原菌的引物组和方法。可以同时检测溶藻弧菌、类志贺毗邻单胞菌、副溶血弧菌、无乳链球菌、霍乱弧菌、创伤弧菌六种人鱼共患病病原菌。针对以上病原菌的特性，设计了6对特异性引物，利用普通的PCR仪即可完成检测。通过琼脂糖电泳即可判断样品中是否含有上述六种病原菌。整个过程操作简单，特异性强，检测成本低。

本发明提供了一种PCR检测人鱼共患病病原菌的方法，包括：

提取溶藻弧菌、类志贺毗邻单胞菌、副溶血弧菌、无乳链球菌、霍乱弧菌、创伤弧菌的基因组DNA；

对病原菌的基因组DNA进行引物设计，引物如下：

溶藻弧菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.1所示，

溶藻弧菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.2所示，

类志贺毗邻单胞菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.3所示，

类志贺毗邻单胞菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.4所示，

副溶血弧菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.5所示，

副溶血弧菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.6所示，

无乳链球菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.7所示，

无乳链球菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.8所示，

霍乱弧菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.9所示，

霍乱弧菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.10所示，

创伤弧菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.11所示，

创伤弧菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.12所示；