[发明专利]一种NK细胞的体外扩增培养方法

权利要求书

1.一种NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向处理后包含NK细胞的血液中加入刺激因子和终浓度为0.1～10nM的比例调节剂，于36.5～37.5℃、5～10％CO₂培养3～4天；

(2)在进行步骤(1)培养的同时调整细胞密度为0.5～1.5×10⁶个/mL，再继续添加终浓度为0.1～10nM的比例调节剂，然后于36.5～37.5℃、5～10％CO₂，添加终浓度为100～500U/mL的细胞因子继续培养20～30天即可。

2.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述刺激因子为通过与NK细胞表面上的受体特异性结合，在该NK细胞的细胞内传递增殖信号或活化信号的功能的因子；或与NK细胞以外的单核细胞的细胞表面的受体结合，诱导体液因子产生释放的因子。

3.根据权利要求1或2所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述刺激因子包括抗CD16抗体、OK432和细胞因子。

4.根据权利要求3所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述抗CD16抗体的终浓度为0.1～10μg/mL；所述OK432的终浓度为0.008～0.015KE/mL；所述细胞因子的终浓度为50～100ng/mL。

5.根据权利要求3所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述细胞因子为白细胞介素、TNF或MCP中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述抗CD16抗体通过固相化方式固定于支持体上。

7.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述比例调节剂为雷帕霉素。

8.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，所述血液的具体处理过程如下：

(1)将从静脉采取的外周全血转移至无菌离心管中，以900～1200g离心10分钟后，收集上清作为血浆；将血浆在56℃下处理30分钟进行灭活，进一步在900～1200g离心10分钟后，于4℃保存，得自体血浆；

(2)向血浆分离后的成分中添加为未分离前的外周全血2倍体积的无菌PBS，制成血细胞溶液；

(3)将血细胞溶液重叠在淋巴细胞分离液上，使用密度梯度离心法除去红细胞、粒细胞，分离得到PBMCs；然后用PBS洗涤分离得到的PBMCs 2～3次；

(4)用X-VIVO 15培养基将PBMCs细胞重悬后接种到培养皿中，贴壁30min后，将悬浮的细胞移入离心管中，并用添加有自体血浆的X-VIVO 15培养基调整PBMCs的细胞密度为1～3×10⁶个/mL即可；所述自体血浆的加入量为X-VIVO 15培养基体积的5～10％。

9.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，步骤(2)中进行培养时，每2～4天补加含有700U/mL的IL-2的X-VIVO 15培养基一次，直至培养结束。

10.根据权利要求1所述的NK细胞体的外扩增培养方法，其特征在于，步骤(2)是通过含有自体血浆的X-VIVO 15培养基来调整细胞密度的；所述自体血浆的加入量为X-VIVO 15培养基体积的5～10％。