[发明专利]一种高活性茯苓纤维素内切酶基因及其蛋白和重组载体

说明书

本发明涉及一种高活力的纤维素内切酶人工合成基因，所述基因为序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示；或者是与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同生物学功能蛋白质的序列。本发明如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用毕赤酵母组成型表达质粒pGAPZα为载体，可实现目标蛋白在毕赤酵母宿主菌X33中的高水平重组分泌表达。同时，筛选的高水平表达转化子利用无机盐高密度发酵可以实现重组蛋白的高水平分泌，且通过简单的镍亲和层析纯化，可得到高活性的新型重组纤维素内切酶蛋白质纯品。重组蛋白具有很强的将纤维素类物质水解并产生葡萄糖的能力，其在生物能源、饲料及食品行业等方面具有重要应用价值。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种新的来源于茯苓的高活性纤维素内切酶基因和编码的蛋白，还涉及由该基因构建的重组载体。

背景技术

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、植物、动物等众多生物体都能产生纤维素酶。可以通过利用生物体产生的纤维素酶添加到纤维素原料中来利用这些原料，因此如何大量生产纤维素酶就成了制约纤维素利用的主要瓶颈。随着生物技术的发展，利用基因工程手段开发高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到国内外学者的重视。目前，纤维素酶基因的克隆及表达已经取得了很大的进展，但是成功获得大量重组纤维素酶的报道还很少。随着纤维素酶在工、农、畜和医学等领域都有广泛的需求，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。

我国土地少且人口多，随着人们生活水平的提高，对肉、蛋白、奶等食物的需求不断提升，人畜争粮的矛盾十分突出。因此，要保持我国饲料、畜牧业的持续发展，必须解决好饲料问题。纤维素是自然界中十分丰富的资源，但纤维素酶的工业化生产受到酶效率低、热稳定性差以及成本较高等诸多因素的限制。随着生物技术的发展，利用基因工程手段开发高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到国内外学者的重视。目前，纤维素酶基因的克隆及表达已经取得了很大的进展，但是还有很大的空间值得人们去研究，开发出越来越多的高活性、高产量的纤维素酶。由于市售纤维素酶往往是众多酶的混合物，很难买到完全由纤维素酶类组成的酶制剂，因此利用基因工程手段逐一生产构成纤维素酶的单体酶成分，再将它们按适当比例混合，是生产纯纤维素酶的可行途径之一。

人工种值条件下，三个月即可结苓，六个月可采挖取茯苓。茯苓种植到收获一般不超过两年，否则因为松木的营养被完全吸收而死亡腐败。木材的主要成分是纤维素、半纤维素和木素，其中，木材纤维素含量为40％～50％。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的可以降解纤维素、木质素、半纤维素等多糖的酶类。所以从茯苓的基因组中人工改造可有望得到具有很高活性的纤维素内切酶。因此，利用基因工程手段高效生产该酶蛋白将有助于研究该酶的作用机理并应用于实际工业生产中。在申请号为201811240264.9和201811281667.8中，以pET28和pET32为载体利用大肠杆菌系统对纤维素内切酶进行了表达并纯化得到一定量活性好的重组蛋白，但利用上述两种载体表达的蛋白都是胞内蛋白，纯化时需要先破碎菌体，纯化步骤比较麻烦且回收率较低。而且在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。酵母是一种高效的外源基因表达体系，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。但每一种蛋白能否实现在酵母中的高水平分泌表达需要合适的基因序列、筛选高水平分泌表达的转化子、优化表达条件和建立高效的蛋白纯化方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种高活性的重组茯苓纤维素内切酶基因，还提供包含该基因的重组载体，以及利用重组载体制备蛋白的方法与应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、本发明提供基因，为编码茯苓纤维素内切酶蛋白的基因，为如下(1)-(2)中任意一种的DNA分子：