[发明专利]一种高活性茯苓纤维素内切酶基因及其蛋白和重组载体

权利要求书

1.一种茯苓纤维素内切酶基因，其特征在于，所述基因的序列如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的基因编码得到的茯苓纤维素内切酶，其特征在于：所述茯苓纤维素内切酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pGAPZαA载体。

6.一种权利要求2所述的茯苓纤维素内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1所述的基因重组到pGAPZαA载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中，再利用Zeocin筛选高表达茯苓纤维素内切酶的转化子；

将步骤1）所得的高表达茯苓纤维素内切酶的转化子用YPG培养基培养至OD₆₀₀为10~15作为种子菌，将种子菌按体积比1：10的比例接种到含有无机盐培养基中进行发酵，发酵为在28℃继续培养72-96小时并不时补加50%的甘油作为碳源，甘油补加速率与溶氧串联，设定发酵的溶氧为25%；利用浓氨水来调节pH，设定发酵的pH为4.0；所得到的上清液中含有大量的茯苓纤维素内切酶蛋白；所述YPG培养基为每升培养基中含有10 g 酵母提取物，20 g蛋白胨，20 g甘油；所述无机盐培养基为每升培养液中包含6克硫酸钾、5克硫酸镁、1克氢氧化钾、7毫升浓磷酸、30克甘油、适量消泡剂和0.3克硫酸钙，氨水调节pH至4.5，湿热灭菌冷却到室后，在接种时，按每升培养基再加入5毫升的微量元素溶液；每升微量元素溶液中包含：65 g FeSO₄·7H₂O, 24 g MoNa₂O₄·2H₂O, 20 g ZnCl₂, 6 g CuSO₄·5H₂O, 3 gMnSO₄·H₂O, 0.5 g CoCl₂, 0.2 g生物素, 0.09 g KI, 0.02 g H₃BO₃ 和5.0 ml浓H₂SO₄。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2）得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含30mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含200 mM咪唑的pH 8.0 缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。

8.根据权利要求6-7任一项所述制备方法得到的茯苓纤维素内切酶在生物能源、饲料及食品行业中的应用。